NEWS

Misaotra anao nitsidika ny Nature.com.Ny kinova browser ampiasainao dia manana fanohanana CSS voafetra.Mba hahazoana traikefa tsara indrindra, manoro hevitra anao izahay hampiasa navigateur nohavaozina (na esory ny Compatibility Mode amin'ny Internet Explorer).Mandritra izany fotoana izany, mba hiantohana ny fanohizana ny fanohanana, dia hanolotra ny tranokala tsy misy fomba sy JavaScript izahay.
Ny selan'ny kansera dia namolavola rafitra isan-karazany mba handresena ny adin'ny sela ary hanohy ny fandrosoana.Ny proteinina kinase R (PKR) sy ny mpihetsiketsika proteinina (PACT) no mpamaly voalohany izay manara-maso ireo famantarana adin-tsaina isan-karazany mitarika amin'ny fanakanana ny fihanaky ny sela sy ny apoptose.Na izany aza, ny fitsipiky ny lalana PACT-PKR amin'ny sela homamiadana dia mbola tsy fantatra.Eto izahay dia nahita fa ny RNA tsy misy kaody lava (lncRNA) aspartyl tRNA synthetase antisense RNA 1 (DARS-AS1) dia mandray anjara mivantana amin'ny fanakanana ny lalana PACT-PKR ary mampiroborobo ny fihanaky ny sela homamiadana.Amin'ny fampiasana screening lehibe amin'ny CRISPRi 971 mifandray amin'ny homamiadana lncRNA, dia hitanay fa ny DARS-AS1 dia mifandray amin'ny fihanaky ny sela homamiadana.Noho izany, ny knockout DARS-AS1 dia manakana ny fihanaky ny sela ary mampiroborobo ny apoptosis sela homamiadana amin'ny tsipika sela homamiadana isan-karazany in vitro ary mampihena be ny fitomboan'ny fivontosana ao amin'ny vivo.Ny mekanika, ny DARS-AS1 dia mifamatotra mivantana amin'ny sehatry ny fampahavitrihana PACT ary manakana ny fifandraisana PACT-PKR, ka mampihena ny fampahavitrihana PKR, eIF2α phosphorylation, ary manakana ny fahafatesan'ny sela apoptotika.Amin'ny klinika, ny DARS-AS1 dia aseho amin'ny karazana kansera marobe, ary ny fihoaram-pefy amin'ity lncRNA ity dia manondro ny tsy fahampian-tsakafo.Ity fanadihadiana ity dia manazava ny fitsipika manokana momba ny homamiadana amin'ny lalan'ny PACT-PKR amin'ny DARS-AS1 lncRNA ary manome tanjona hafa ho an'ny homamiadana sy fitsaboana.
Ny fahafahana mampifanaraka ny adin-tsaina dia toetra manan-danja amin'ny fahaveloman'ny sela homamiadana sy ny fihanaky ny homamiadana.Ny fihanaky haingana sy ny mari-pandrefesana metabolika amin'ny homamiadana dia mihamitombo amin'ny tontolo mikraoba - ny tsy fahampian-tsakafo, ny hypoxia ary ny pH ambany - izay mety hitarika ny lalan'ny fahafatesan'ny sela.Ny dysregulation ny fototarazo saro-pady toy ny p535, proteinina fahatairana 6, 7, KRAS8, 9, ary HIF-110, 11, 12, 13 dia hita matetika amin'ny homamiadana, ka manakana ny apoptose ary mampiroborobo ny fahavelomana.
Protein kinase R (PKR) dia zava-dehibe sensor ny adin-tsaina sy ny subunit kinase ny eukaryotic initiation factor 2α (eIF2α), mpandrindra fandikana izay mampifandray ny sela adin-tsaina amin'ny fahafatesana sela.Ny PKR dia fantatra tamin'ny voalohany ho proteinina antiviral tamin'ny alàlan'ny fahitana ny RNA mitongilana roa (dsRNA) vahiny.Rehefa vita ny fampahavitrihana, PKR phosphorylates eIF2α mba hanakanana ny virosy sy ny sela proteinina synthesis14,15,16.Ny PACT (proteinina mpikatroka PKR) dia fantatra fa proteinina mpikatroka PKR voalohany raha tsy misy ny dsRNA17,18,19,20,21,22,23.Amin'ny alàlan'ny fifandraisana mivantana amin'ny PKR, ny PACT dia mamindra ny adin-tsaina isan-karazany (ny mosary serum, ny peroxyde na ny fitsaboana arsenite) mankany amin'ny PKR sy ny lalan'ny famantarana midina.Ho fanampin'ny phosphorylation eIF2α, ny fampahavitrihana PKR-mediated PACT dia miteraka hetsika isan-karazany mifandraika amin'ny valin'ny adin-tsaina, anisan'izany ny fiovan'ny redox amin'ny alàlan'ny lalana PI3K / Akt24, fanatsarana ny fahasimban'ny ADN amin'ny alàlan'ny p5325,26 sy NF-κB27,28 Regulates transcription, 29. Noho ny anjara asany manan-danja amin'ny valin'ny adin-tsaina, ny fihanaky, ny apoptose ary ny fizotran'ny sela lehibe hafa, ny PKR sy ny PACT dia mampanantena tanjona fitsaboana ho an'ny aretina maro, indrindra ny homamiadana30,31,32,33.Na izany aza, na dia eo aza izany dikany pleiotropika sy biolojika izany, ny fifehezana ny asan'ny PACT/PKR amin'ny sela homamiadana dia mijanona ho sarotra.
lncRNAs dia transcripts lehibe kokoa noho ny 200 nucleotides tsy misy proteinina-kodiarana.Hatramin'ny nahafantarana ny lncRNA an'arivony ny tetik'asa fandrindrana genome manontolo, 35,36 dia ezaka be no natao mba hanazavana ny asany biolojika.Ny vondron'ny fikarohana mitombo dia naneho fa ny lncRNAs dia tafiditra amin'ny fizotran'ny biolojika maro37 ao anatin'izany ny fifehezana ny tsy fihetsehan'ny X-chromosome38,39, fanontana40, transcription41,42, fandikana43 ary na dia ny fitomboan'ny homamiadana44,45,46,47 aza.Ireo fanadihadiana ireo dia nitatitra fa maro ny lncRNA no tafiditra amin'ny lalana PACT/PKR.Ny fandinihana iray toy izany dia nampiseho fa ny lncRNA ASPACT dia nanakana ny transcription PACT ary nitombo ny fihazonana nokleary ny PACT mRNA.Ny fandinihana hafa dia naneho fa ny lncRNA nc886 dia mifatotra amin'ny PKR ary manakana ny phosphorylation49,50.Hatreto, ny lncRNA mifehy ny fampahavitrihana PKR-mpanelanelana amin'ny PACT dia tsy mbola notaterina.
Aspartyl-tRNA synthetase antisense RNA 1 (DARS-AS1) dia fantatra ho lncRNA51,52,53,54 oncogenic.Amin'ny alàlan'ny fifehezana ny miP-194-5p53, miP-12952 ary miP-532-3p51, ny DARS-AS1 dia naseho hampiroborobo ny fitomboan'ny kanseran'ny sela sela mazava, ny homamiadan'ny tiroida ary ny kanseran'ny havokavoka tsy kely.Hitan'i Tong sy ny mpiara-miasa ihany koa fa ny DARS-AS1 dia mampiroborobo ny fivoaran'ny myeloma amin'ny fitazonana ny fahamarinan'ny proteinina 39 (RBM39) RNA-binding motif.Na izany aza, tsy nisy fanadihadiana natao momba ny hoe ity lncRNA ity dia tafiditra amin'ny fifehezana ny fampahavitrihana PACT-PKR sy ny valin'ny adin'ny sela homamiadana.
Eto izahay dia nanao efijery fatiantoka lehibe amin'ny fampiasana ny rafitra CRISPRi ary nanapa-kevitra fa ny DARS-AS1 lncRNA dia mampiroborobo ny fihanaky ny karazana sela homamiadana.Ankoatra izany, dia nahita mekanika lehibe izahay: DARS-AS1 dia mifamatotra mivantana amin'ny PACT, manakana ny PACT sy PKR mamatotra, manakana ny phosphorylation ny eIF2α, substrate PKR ambany, ary amin'ny farany dia manakana ny fahafatesan'ny sela apoptotika.Ho fehiny, ny asantsika dia manambara ny DARS-AS1 lncRNA ho mpandrindra ny lalan'ny PACT-PKR ary mety ho lasibatra amin'ny fitsaboana sy ny fitsaboana homamiadana.
Ny fanadihadiana momba ny génomika be dia be dia nahitana lncRNA an-jatony mifandray amin'ny homamiadana.Na izany aza, mbola tsy fantatra ny asan'izy ireo56.Mba hamantarana ireo kandidà lncRNA mampanantena mandray anjara amin'ny fivoaran'ny homamiadana, dia nanao efijery very-of-function izahay mba hampihenana ny fihanaky ny sela homamiadana SW620 amin'ny alàlan'ny rafitra CRISPRi (sary 1a).Ny endri-javatra miavaka amin'ny tsipika sela homamiadan'ny tsinaibe SW480 sy SW620 dia avy amin'ny fivontosana voalohany sy faharoa amin'ny marary iray.Izany dia manome fampitahana sarobidy amin'ny fandalinana ny fiovan'ny fototarazo amin'ny fivoaran'ny homamiadan'ny tsinaibe.Noho izany, dia nandinika ny transcriptomes ny tsipika sela homamiadana colorectal (SW480 sy SW620) mampiasa RNA sequencing ary nanangona ny sasany mety miasa lncRNAs avy amin'ny boky navoaka.Miorina amin'ireo valiny ireo, dia nanamboatra tranomboky sgRNA mitambatra misy oligos 7355 sgRNA mikendry ny lncRNAs 971 mifandray amin'ny homamiadana sy oligos sgRNA 500 tsy voatanisa ho an'ny fanaraha-maso ratsy (Data fanampiny 1).
Fampisehoana schematic amin'ny screening mampiasa ny rafitra CRISPRi.b sgRNA fanatsarana aorian'ny fitiliana.Ny tsipika mitsivalana mitsivalana dia maneho ny log2 (fiovan'ny vala) = ± 0,58.Ny tsipika mitsangana mitsangana dia manondro ny sanda p = 0.05.Ny teboka mainty dia maneho ny sgRNA tsy misy tanjona (voatondro ho NC).Ny teboka mena dia sgRNA mikendry ny DARS-AS1.Ny teboka manga dia sgRNA mikendry ny LINC00205, lncRNA oncogenic voalaza teo aloha.fiovana mivalona = (famakiana ara-dalàna, andro faha-17)/(famakiana ara-dalàna, andro 0).c DARS-AS1 sgRNA knockdown nanakana ny fitomboan'ny sela.Ny barana diso dia maneho ± fivilian-dàlana mahazatra amin'ireo andrana telo.* p ≤ 0.05, ** p ≤ 0.01 roa-tailed Student's t-test.d DARS-AS1 amin'ny fivontosana (dataset TCGA).em Ny fanehoana ny DARS-AS1 amin'ny santionany ara-dalàna sy ny tumora avy amin'ny marary miaraka amin'ny BLCA, KIRC, PRAD, LUSC, UCEC, LUAD, LIHC, KIRP, ary COAD, tsirairay avy (dataset TCGA).p-values ​​dia azo tamin'ny fampiasana ny t-test Student roa-tailed.
Taorian'ny nananganana ny plasmid sy ny famenoana ny lentivirus, dia nafindranay ny tsipika sela homamiadana colorectal dCas9-SW620 miaraka amin'ny tranomboky etsy ambony amin'ny fanandramana otrikaretina tsy miankina efatra.Ny hamaroan'ny aretina (MOI) ho an'ireo otrikaretina ireo dia 0.1-0.3, izay manondro fa ny sela tsirairay dia tsy afaka mamindra afa-tsy amin'ny sgRNA iray.Taorian'ny 18 andro tamin'ny kolontsaina in vitro dia nihena na nitombo ny mombamomba ny sgRNA kendrena taorian'ny fitiliana, raha mbola tsy niova ny isan'ny oligonucleotides fanaraha-maso tsy misy lasibatra raha oharina amin'ny mombamomba ny fitiliana mialoha, izay manondro fa manana efijery manokana ny tanjonay. tranomboky.vary.1b sy tabilao fanampiny 1). LINC00205, izay voalaza teo aloha fa hampiroborobo ny homamiadan'ny havokavoka sy ny fivoaran'ny homamiadan'ny atiny58,59,60, dia nojerena (log2 (foldchange) <−0.58, p value <0.05), nanamafy ny fahamendrehan'ity screening ity (sary 1b). LINC00205, izay voalaza teo aloha fa hampiroborobo ny homamiadan'ny havokavoka sy ny fivoaran'ny homamiadan'ny atiny58,59,60, dia nojerena (log2 (foldchange) <−0.58, p value <0.05), nanamafy ny fahamendrehan'ity screening ity (sary 1b). LINC00205, о котором ранее сообщалось, что он способствует прогрессированию рака легких и рака печени58, 59, 60, был исключен (log2 (кратное изменение) <-0,58, значение p <0,05), что подтверждает надежность этого скрининга (рис .1b). LINC00205, voalaza teo aloha fa hampiroborobo ny fivoaran'ny homamiadan'ny havokavoka sy ny homamiadan'ny atiny58,59,60, dia nesorina (log2 (fiovan'ny fony) <-0.58, p-value <0.05), manamafy ny hamafin'ity screening ity (sary .1b) . Linc00205 之前 被 报道 可 促进 肺癌 和 肝癌 进展 58,59,60, 被 筛 选 掉 (Log2 (倍数 变化) <-0.58, p 值 <0.05), 证实 了 该 筛选 的的 (图 1b). Linc00205 之前 被 报道 可 促进 肺癌 和 肝癌 进展 58,59,60, 被 筛 选 掉 (Log2 (倍数 变化) <-0.58, p 值 <0.05), 证实 了 该 筛选 的的 (图 1b). LINC00205, о котором ранее сообщалось, что он способствует прогрессированию рака легких и печени58, 59, 60, был исключен (log2 (кратное изменение) <-0,58, p-значение <0,05), что подтверждает надежность этого скрининга (рис .1b). LINC00205, voalaza teo aloha fa hampiroborobo ny fivoaran'ny homamiadan'ny havokavoka sy ny aty58,59,60, dia nesorina (log2 (fiovan'ny fony) <-0.58, p-value <0.05), nanamafy ny hamafin'ity screening ity (sary .1b).
Amin'ireo lncRNA rehetra nosedraina, dia nojerena ihany koa ny DARS-AS1, miaraka amin'ireo oligonucleotides sgRNA cognate telo dia nihena be taorian'ny kolontsaina 18 andro, izay nanoro hevitra fa ny fandonana an'io lncRNA io dia nahatonga ny fihanaky ny homamiadana (sary 1b).Ity valiny ity dia notohanan'ny famakafakana MTS amin'ny sela homamiadana colorectal izay mampiseho fa ny tahan'ny fitomboan'ny sela knockdown DARS-AS1 dia nihena afa-tsy tamin'ny antsasany raha oharina amin'ny sela mifehy (sary 1c) ary nifanaraka tamin'ny tatitra teo aloha momba ny karazana homamiadana hafa.: homamiadan'ny voa sela mazava, homamiadan'ny tiroida ary homamiadan'ny havokavoka tsy sela kely51,52,53,55.Na izany aza, ny asany sy ny mekanika molekiola amin'ny homamiadan'ny koloro dia mbola tsy fantatra.Noho izany, nisafidy ity lncRNA ity izahay mba hianarana bebe kokoa.
Mba handalinana ny fitenin'ny DARS-AS1 amin'ny marary, dia nandinika tanteraka ny santionan'ny fivontosana 10,327 avy amin'ny tetikasa Cancer Genome Atlas (TCGA) izahay.Ny vokatray dia mampiseho fa ny DARS-AS1 dia naseho be dia be ary nitombo be tamin'ny sela salama amin'ny fivontosana isan-karazany, anisan'izany ny colon adenocarcinoma (COAD), ny kanseran'ny sela mazava (KIRC), ary ny carcinoma sela papillary renal (KIRP)..Vitsy dia vitsy (sary 1d sy sary fanampiny 1a, b). Ny famakafakana ny santionany ara-pahasalamana / fivontosana mitambatra dia nanamafy ny fanehoana avo kokoa ny DARS-AS1 amin'ny fivontosana amin'ny kanseran'ny urothelial bladder (BLCA), kanseran'ny sela voa (KIRC), prostate adenocarcinoma (PRAD), kanseran'ny sela squamous (LUSC) , carcinoma endometrial uterine corpus (UCEC), adenocarcinoma havokavoka (LUAD), carcinoma hepatocellular aty (LIHC), carcinoma sela papillary renal (KIRP), ary adenocarcinoma colon (COAD) (p value <0.05) (sary 1e-m) . Ny famakafakana ny santionany ara-pahasalamana / fivontosana mitambatra dia nanamafy ny fanehoana avo kokoa ny DARS-AS1 amin'ny fivontosana amin'ny kanseran'ny urothelial bladder (BLCA), kanseran'ny sela voa (KIRC), prostate adenocarcinoma (PRAD), kanseran'ny sela squamous (LUSC) , carcinoma endometrial uterine corpus (UCEC), adenocarcinoma havokavoka (LUAD), carcinoma hepatocellular aty (LIHC), carcinoma sela papillary renal (KIRP), ary adenocarcinoma colon (COAD) (p value <0.05) (sary 1e-m) .Ny famakafakana ny santionany ara-pahasalamana / fivontosana dia nanamafy ihany koa ny fanehoana avo kokoa ny DARS-AS1 amin'ny kanseran'ny urothelial bladder (BLCA), kanseran'ny sela renal sy renal cellule (KIRC), prostate adenocarcinoma (PRAD), tumors lung squamous cell carcinoma (LUSC)., карцинома эндометрия тела матки (UCEC), аденокарцинома легкого (LUAD), гепатоцеллюлярная карцинома печени (LIHC), папиллярно-клеточная карцинома почки (KIRP) и аденокарцинома толстой кишки (COAD) (значение p <0,05) (рис. 1e– m). , carcinoma endometrial an'ny corpus uteri (UCEC), adenocarcinoma of the lung (LUAD), hepatocellular carcinoma of the liver (LIHC), papillary cell carcinoma of the renal (KIRP), ary adenocarcinoma of the colon (COAD) (p value < 0.05) (sary 1e– m).配对 健康 / 肿瘤样本 的 分析 进一步 证实 了 dars-as1 在 膀胱 尿路 上 皮癌 (BLCA), 肾 肾 透明 细胞癌 (Kirc), 前列 腺腺癌 (prad), 肺鳞状 细胞癌 (lusc) 肿瘤 中 的显着 更 高 表达, 子宫体子宫 内膜 癌 (ucec), 肺腺癌 (Luad), 肝肝 细胞癌 (lena), 肾 肾 乳头状 细胞癌 (kirp) 和结肠腺癌 (coad) 和结肠腺癌 (coad) (p 值) (p 值) <0.05）（图1e-m） .配 对 健康 / 肿瘤样本 的 分析 了 wars-os1 在 尿路 上 皮癌 皮癌 皮癌 皮癌, 肾 肾 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 前列 腺腺癌 腺腺癌 (prad), 细胞癌 细胞癌(Lusc) 肿瘤 的 的 的 的 中 Izy К К К К К Ко癌 （kirp） （coad） （p 值<0.05）（图1e-m） .Ny famakafakana ny santionany ara-pahasalamana / fivontosana dia nanohana bebe kokoa ny anjara asan'ny DARS-AS1 amin'ny kanseran'ny urothelial bladder (BLCA), kanseran'ny sela sela mazava (KIRC), prostate adenocarcinoma (PRAD), ary kanseran'ny sela squamous sela (LUSC).экспрессия при карциноме тела матки (UCEC), аденокарциноме легкого (LUAD), гепатоцеллюлярной карциноме (LIHC), почечно-почечной папиллярно-клеточной карциноме (KIRP) и аденокарциноме толстой кишки (COAD) (значение p <0,05) (рис. 1e -m). fitenenana ao amin'ny corpus uterine carcinoma (UCEC), lung adenocarcinoma (LUAD), hepatocellular carcinoma (LIHC), renal papillary cell carcinoma (KIRP), ary colon adenocarcinoma (COAD) (p value <0.05) (sary 1e -m).Raha atambatra, ireo valiny ireo dia manondro fa ny DARS-AS1 dia be dia be ary aseho amin'ny karazana homamiadana isan-karazany.
Satria ny DARS-AS1 sy ny DARS (ny fototarazon'ny tadin'ny antisense) dia mizara mpanentana mitovy ary mifanakaiky, dia nanamboatra ny shRNA izahay mba handotoana manokana ny DARS-AS1 fa tsy ny DARS (sary fanampiny 2a, b ary tabilao fanampiny 2) .Ho fanampin'ny SW620, dia nampiasa andalana telo hafa ihany koa izahay izay maneho ny DARS-AS1 mba handinihana ny fahombiazany sy ny fiasan'ny shRNA knockdown (Tabilao fanampiny 3).Ny valiny dia nanondro fa ny shRNA telo rehetra novolavolaina dia nahatratra 80% farafahakeliny DARS-AS1 fahombiazan'ny knockdown ary tsy dia misy fiantraikany amin'ny habetsahan'ny DARS mRNA (Fanampiana 2c-f).Ho fanampin'izany, hitanay fa ny fandosiran'ny DARS-AS1 miaraka amin'ireo shRNA ireo dia nanakana ny fitomboan'ny sela amin'ny tsipika sela kanseran'ny koloro SW620 (49.7%) sy HCT116 (27.7%), ny tsipika sela homamiadan'ny nono MBA-MD-231 (53.4%).) ary ny HepG2 hepatoma cell line (92.7% reduction), ary koa ny fahafahany mamorona spheres tsy misy tariby (mihena ny salan'isa ~ 50.8%, 44.6%, 40.7% ary 75.7% isaky ny cell line) (sary 2a, b).Ao amin'ny SW620, ny valin'ny fanadihadiana momba ny fananganana zanatany dia nanamafy fa ny DARS-AS1 shRNA dia nanakana ny fihanaky ny sela miaraka amin'ny fihenan'ny 69.6% eo ho eo (sary 2c).
Ny fiantraikan'ny shRNA fanaraha-maso sy ny DARS-AS1 shRNA amin'ny fitomboan'ny sela (a) sy ny fananganana spheroid (b) ao amin'ny sela SW620, HCT116, MBA-MD-231, ary HepG2.c Ny fiantraikan'ny shRNA fanaraha-maso sy ny DARS-AS1 shRNA amin'ny fananganana zanatany ao amin'ny sela SW620.Ny fihanaky ny sela (d), ny fananganana spheroid (e), ary ny fananganana zanatany (f) ny sela SW620 izay maneho ny DARS-AS1.Ny angon-drakitra aseho dia ny mean ± fivilian-dàlana mahazatra amin'ny fanandramana telo.* p ≤ 0.05, ** p ≤ 0.01, ary *** p ≤ 0.001 amin'ny t-test an'ny mpianatra roa-tailed.
Mba hamenoana ny fanadihadiana momba ny fahaverezan'ny asa, dia namorona sela SW620 izahay manasongadina ny DARS-AS1 (sary fanampiny 2g).Ny fihoaram-pefy DARS-AS1 dia nampitombo be ny fitomboan'ny sela (1.8-fold), ny fananganana spheroid tsy misy ifandraisany (1.4-fold), ary ny fananganana zanatany (3.3-fold) ao amin'ny sela SW620 (sary 2d-f).Nohamafisinay io valiny io tamin'ny fampiasana tsipika finday iray hafa milaza ny DARS-AS1, A549.Ity fitomboan'ny sela ity noho ny fihoaram-pefy DARS-AS1 dia voamarika bebe kokoa ao amin'ny sela A549 (sary fanampiny 2h, i ary tabilao fanampiny 3).Raha atambatra, ireo fandalinana tombony sy fatiantoka ireo dia mampiseho fa ny DARS-AS1 dia mampiroborobo ny fihanaky ny sela homamiadana in vitro.
Mba hijerena ny mekanika fototra izay ahafahan'ny DARS-AS1 mifehy ny fihanaky ny sela, dia nanao famakafakana midina RNA izahay mba hamantarana ireo mpiara-miombon'antoka proteinina mety aminy.Ny valin'ny RT-qPCR dia mampiseho fa manodidina ny 86.2% amin'ny DARS-AS1 dia hita ao amin'ny cytoplasm amin'ny sela SW620 (fanampiny sary 3a).Ny biotinylated DARS-AS1 na pseudoRNA in vitro dia natsofoka tamin'ny lysates sela SW620 arahin'ny fisarahana SDS-PAGE.Ny fametahana volafotsy manaraka dia nampiseho fa ny tarika miavaka (~ 38 kDa) dia nanankarena be tamin'ny santionany misintona DARS-AS1 fa tsy amin'ny santionany RNA na vakana (sary 3a).Ity tarika ity dia fantatra fa PKR activating protein (PACT) amin'ny alàlan'ny mass spectrometry (MS) ary nohamafisin'ny immunoblotting amin'ny SW620, HCT116, ary HepG2 cell line (sary 3a, b).Ny fampitomboana ny DARS sy ny proteinina PACT mifandraika amin'izany - PKR sy TRBP - dia nohadihadiana ihany koa tamin'ny famakafakana RNA avy amin'ny Western blotting (WB).Ny valiny dia nanondro fa tsy nisy fifandraisana mivantana teo amin'ny DARS-AS1 RNA sy ireo proteinina telo ireo (sary fanampiny 3b).Ny fifandraisana manokana eo amin'ny DARS-AS1 sy ny PACT dia nohamafisin'ny fanadihadiana RNA immunoprecipitation (RIP), izay nampiseho fa ny DARS-AS1 dia nanankarena be tamin'ny anti-PACT antibody fa tsy ny RNA hafa mifehy (sary 3c).Mba hamaritana raha mifandray mivantana amin'ny PACT ny DARS-AS1 raha tsy misy singa hafa amin'ny sela, dia natao ny fitiliana in vitro biolayer interferometry (BLI) tamin'ny fampiasana PACT voadio.Ny biotin-marika DARS-AS1 na dummy RNA dia tsy nihetsika tamin'ny biosensors streptavidin (SA) ary avy eo dia nampidirina tao anaty buffer kinetika misy 1 μM PACT.Marihina fa ny PACT dia mifamatotra mafy amin'ny DARS-AS1 (KD value ~ 26.9 nM), fa tsy maka tahaka ny RNA (sary 3d).Raha atambatra, ireo vokatra ireo dia mampiseho fifandraisana mivantana sy fifandraisana ambony eo amin'ny DARS-AS1 sy PACT.
Ny famakafakana RNA pull dia fantatra fa DARS-AS1 mifandray amin'ny PACT ao amin'ny sela SW620.Ambony, fandokoana volafotsy amin'ny proteinina mifandraika amin'izany.Ny immunoblots ambany dia natao tamin'ny antibody anti-PACT.b Ny famakafakana midina RNA dia natao tao amin'ny sela HCT116 (ambony) sy HepG2 (ambany).Ny fanatsarana ny PACT dia hita tamin'ny immunoblotting.Ny fitiliana immunoprecipitation (RIP) cRNA dia natao tao amin'ny sela SW620 tamin'ny fampiasana ny antibody voalaza.d PACT mamatotra curve amin'ny lavany DARS-AS1 na fanaraha-maso RNA dia azo tamin'ny alalan'ny biolayer interferometry (BLI).Ny RNA dia tsy mihetsika amin'ny biosensor streptavidin.1 μM PACT dia nampiasaina mba handrefesana ny fikambanana.e RNA pull assay dia natao tamin'ny alàlan'ny biotinylated feno DARS-AS1 na tapaka (ambony).Immunoblot mampiseho PACT azo (ambany).f Ny PACT voadio voadio dia natsipy niaraka tamin'ny DARS-AS1 feno biotinylated na notapatapahina (toy ny ao amin'ny e) ho an'ny in vitro RIP assay.Ny RNA nalaina dia nohamarinin'ny RT-qPCR.g Ny fifandraisana akaiky amin'ny sombintsombin'ny RNA samihafa ho an'ny PACT dia azo tamin'ny fampiasana interferometry biolayer.Ho an'ny fanadihadiana, 100 nM RNA sy 1 μM RAST no nampiasaina.h In vitro RIP assays dia natao tamin'ny alalan'ny PACT voadio na notapatapahina marika.Ny RNA nalaina dia nohamarinin'ny RT-qPCR.i Taham-pitomboan'ny sela SW620 mihoa-pampana ny DARS-AS1, PACT, na izy roa.j Ny fanehoana be loatra ny DARS-AS1 lava lava na voatapaka ao amin'ny sela SW620 dia nisy fiantraikany samihafa tamin'ny fitomboan'ny sela.k Apoptosis dia hita tamin'ny immunoblotting miaraka amin'ny anti-PARP antibody.l Knockout ny DARS-AS1 dia miteraka apoptosis amin'ny sela SW620 araka ny asehon'ny cytometry.Ny angon-drakitra aseho dia ny mean ± fivilian-dàlana mahazatra amin'ny fanandramana telo. *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p <0.0001, tamin'ny fitsapana t an'ny Mpianatra roa. *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p <0.0001, tamin'ny fitsapana t an'ny Mpianatra roa. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p <0.0001 amin'ny t-test an'ny mpianatra roa-tailed. *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p < 0.0001，通过双尾学生t 检验。 *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p < 0.0001，通过双尾学生t 检验。 *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p <0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p <0.0001 amin'ny t-test an'ny mpianatra roa-tailed.
Avy eo izahay dia namorona sombintsombiny DARS-AS1 RNA biotinylated telo tamin'ny alàlan'ny transcription in vitro hamantarana ny faritra DARS-AS1 takiana amin'ny fikambanana PACT (sary 3e).Ny valin'ny famakafakana RNA dia naneho fa ny ampahany tsirairay dia afaka mifandray amin'ny PACT, fa ny faritra 3′-terminal (384-768 nucleotides misy marika A3) dia nampiseho mihoatra ny 1-384 nucleotides misy marika A1) (sary 3e).Ny vokatra mitovy amin'izany dia hita tao amin'ny in vitro RIP assay tamin'ny fampiasana PACT recombinant (sary 3f).Mifanaraka amin'ireo valiny ireo, ny fanandramana hamehezana ny sombintsombin'ny RNA tsy mihetsika amin'ny PACT amin'ny fampiasana BLI dia nampiseho ihany koa fa ny PACT dia manana fifandraisana ambony kokoa amin'ny A3 (384-768 nt) (kD eo ho eo amin'ny 94.6 nM), raha tsy misy fifandraisana amin'ny faritra hafa.(sary 3d).
Nandinika ireo faritra mifamatotra mifandraika amin'ny PACT ihany koa izahay.Ny PACT dia misy sehatra telo miasa, ny roa amin'izy ireo dia voatahiry domaine RNA-binding double-stranded (dsRBD) ary sehatra fahatelo (voatondro D3) izay miasa ho toy ny activator ny fifandraisana proteinina.Mba handinihana ny fahaiza-manaon'ny lncRNA amin'ny sehatra tsirairay, dia namorona fiovana telo izahay izay nanala ny tsirairay amin'ireo sehatra telo ary nanao fitiliana RIP in vitro.Ny valiny dia naneho fa ny famafana ny sehatra fahatelo (D3) an'ny PACT dia nampihena be ny fifandraisany amin'ny DARS-AS1 (amin'ny 0.11-fold raha oharina amin'ny PACT tsy misy dikany) raha oharina amin'ireo fiovana roa hafa (sary 3h), dia naseho fa ny famoahana ny D3 dia nifanerasera tamin'ny DARS.-AC1.Raha atambatra, ireo valiny ireo dia manoro hevitra fa ny fifandraisana eo amin'ny DARS-AS1 sy ny PACT dia mety hitranga voalohany indrindra amin'ny faran'ny 3′ an'ny DARS-AS1 sy ny sehatra D3 an'ny PACT.
Nanamarika izahay fa ny DARS-AS1 dia tsy nisy fiantraikany tamin'ny fanehoana PACT ary ny PACT dia tsy nisy fiantraikany tamin'ny DARS-AS1 (Fanampiana 3c).Avy eo dia nandinika ny fiantraikan'ny PACT knockdown amin'ny fitomboan'ny sela.Mifanohitra amin'ny DARS-AS1, ny sela havana dia nitombo 1.5-3 heny haingana kokoa rehefa nazera ny PACT (sary fanampiny 3d).Ny valin'ny fanadihadiana momba ny fananganana zanatany dia nanondro fa ny sela dia namorona zanatany 2-3-fold taorian'ny fitsaboana shRNA miaraka amin'ny PACT (sary fanampiny 3e).Mba hitsapana raha manara-maso ny fihanaky ny sela amin'ny alàlan'ny PACT ny DARS-AS1, dia namokatra sela SW620 mahery vaika ny PACT, DARS-AS1, na izy roa.Ny overexpression ny PACT dia nampiseho fampihenana lehibe ny fihanaky ny sela (sary 3i).Raha toa ka nampiroborobo ny fihanaky ny sela ny DARS-AS1, dia tsy nisy fahasamihafana lehibe teo amin'ny taham-pitomboan'ny sela mihoapampana ny DARS-AS1 sy PACT.Ireo vokatra ireo dia manondro fa ny PACT dia mety hanohitra ny fitomboan'ny fitomboana vokatry ny fihoaram-pefy DARS-AS1.
Koa satria ny faritra samihafa ao amin'ny DARS-AS1 dia manana fahaiza-manao mifandraika amin'ny PACT, dia nanadihady ny fiantraikan'izy ireo amin'ny fihanaky ny sela amin'ny alàlan'ny fisondrotan'ny singa DARS-AS1 samihafa.Raha ampitahaina amin'ireo sombiny roa hafa, ny DARS-AS1 dia navotsotra tamin'ny faran'ny 3' (384-768 nt), ny faritra lehibe indrindra mifandraika amin'ny PACT ao amin'ny DARS-AS1, izay nanana ny fahaiza-manao ambony indrindra hanentanana ny fitomboan'ny sela (sary 3j).Ireo vokatra ireo dia manondro fifandraisana tsara eo amin'ny fahaiza-manaon'ny biolojika sy ny fiasan'ny DARS-AS1.
Ny PACT dia voalaza fa proteinina pro-apoptotic19.Noho izany dia nanadihady ny fiantraikan'ny DARS-AS1 amin'ny apoptose izahay.Araka ny efa nampoizina, ny fandoroana DARS-AS1 dia nampitombo be ny fiparitahan'ny PARP tao amin'ny sela SW620 ary nampitombo ny isan'ny sela annexin V-positive ao amin'ny SW620, HCT116, HepG2, ary ny tsipika sela MBA-MD-231 (sary 3k).3).3f-h), izay manondro fa ny fiantraikan'ny anti-apoptotic an'ny DARS-AS1 amin'ny sela homamiadana dia mifanohitra amin'ny asan'ny apoptosis-induced PACT.Raha atambatra, ireo valiny ireo dia manoro hevitra fa ny mekanika amin'ny asa oncogenic DARS-AS1 dia mety amin'ny alàlan'ny fanakanana ny asan'ny PACT.
Avy eo dia nandinika ny fiantraikan'ny fikambanana DARS-AS1-PACT izahay.Ny PACT dia voalaza fa manetsika ny PKR amin'ny alàlan'ny fifandraisana mivantana, izay manatsara ny phosphorylation eIF2α, ka mahatonga ny famafana ny fandikana sy ny apoptose17.Voalohany, nandinika izahay raha misy fiantraikany amin'ny toerana misy ny PACT sy PKR ny DARS-AS1.Ny mikroskopika fluorescence confocal dia naneho fa ny PACT sy ny PKR dia niparitaka be tao amin'ny sela SW620 miaraka amin'ny coefficient correlation Pearson amin'ny 0.72.Mandritra izany fotoana izany, ny overexpression DARS-AS1 dia nampihena be ny PACT sy ny fiaraha-miasa amin'ny PKR (midika hoe coefficient correlation Pearson 0.61) (sary 4a).Mba hanadihadiana raha afaka manova ny fifandraisan'ny PACT-PKR ny DARS-AS1, dia nanao fitiliana co-immunoprecipitation (co-IP) miaraka amin'ny antibody anti-PACT ao amin'ny lysates sela SW620 izahay.Ny PKR dia nanan-karena be tamin'ny anti-PACT tao amin'ny sela fanaraha-maso, raha nihena be kosa ny fanarenana ny PKR tamin'ny lysates avy amin'ny cellules overexpressing DARS-AS1 (sary 4b).Ny PACT sy PKR voadio voadio dia nampiasaina ho an'ny fitiliana proteinina in vitro.Noho izany, ireo izay nanome DARS-AS1 fa tsy misy RNA fanaraha-maso dia naneho ny fifandraisana PACT-PKR (sary 4c).Ny valiny rehetra dia naneho fa ny DARS-AS1 dia nanakorontana ny fifandraisana PACT sy PKR.
Ny fiaraha-miombon'antoka amin'ny PACT sy PKR amin'ny sela fanaraha-maso na cellules overexpressing DARS-AS1 dia voamarika tamin'ny fampiasana microscopy fluorescence confocal.Nolotoina tamin'ny DAPI ny nosy.Ny valin'ny antontan'isa dia azo tamin'ny sary 16.b Co-immunoprecipitation (co-IP) mampiasa antibody anti-PACT ao amin'ny lysates sela mifehy ny sela SW620 na ny cellules overexpressing DARS-AS1.c PACT nasiana marika, PKR nodiovina ary nosoratana in vitro miaraka amin'ny DARS-AS1 na mock RNA dia natsipy ho an'ny famakafakana proteinina in vitro.Ny antibody anti-flag dia nampiasaina ho an'ny immunoprecipitation.d Immunoblots miaraka amin'ny antibody voalaza dia natao tao amin'ny sela SW620 sy HCT116 nafindra tamin'ny shRNA fanaraha-maso na DARS-AS1-shRNA arahin'ny mosary serum.e Ny haavon'ny fitenenana DARS-AS1 dia nanova ny fahatsapan'ny sela amin'ny thapsigargin.Ny sela SW620 dia nafindra tamin'ny DARS-AS1 shRNA, DARS-AS1 overexpression plasmid na control plasmid.Notsaboina tamin'ny thapsigargin nandritra ny 48 ora ny sela ary nofaritana tamin'ny fampiasana ny reagent MTS ny sela.f In vitro transcribed DARS-AS1 na dummy RNA sy PACT voadio dia nampiasaina ho an'ny in vitro activation assay sy immunoblot detection.g Immunoblots mampiasa ireo antibody ireo dia natao tamin'ny sela SW620-ctrl (ankavia) na sela mihoatra ny mutant PKR (ankavanana).Ireo sela ireo dia nafindra tamin'ny fanaraha-maso shRNA na DARS-AS1-shRNA arahin'ny mosary serum.h Flow cytometry dia naneho fa ny tsy fampandehanana ny mutant PKR dia nanonitra ny apoptose DARS-AS1-induced ao amin'ny sela SW620.i Immunoblots miaraka amin'ny antibody voalaza dia natao tao amin'ny sela SW620 (ankavia) na HCT116 (ankavanana).Ny sela nafindra tamin'ny shRNA fanaraha-maso na DARS-AS1 shRNA dia tsy misy serum ary ampiana amin'ny 100 nM PKR C16 inhibitor na DMSO.Bara mizana = 5 µm.Ny angon-drakitra aseho dia ny mean ± fivilian-dàlana mahazatra amin'ny fanandramana telo.* p ≤ 0.05 t-test an'ny mpianatra roa rambo.
Amin'ny ankapobeny dia inoana fa rehefa mifandray amin'ny PKR17 ny PACT, dia mety ho voatarika ny phosphorylation PKR amin'ny Thr451.Ny valiny dia nanondro fa ny haavon'ny phosphorylation PKR dia nitombo be tao amin'ny cellule knockdown DARS-AS1 taorian'ny mosary serum (sary 4d sy sary fanampiny 4a).Araka izany, hitanay fa ny phosphorylation ny eIF2α, ny substrate PKR lehibe indrindra, dia nitombo be ihany koa tamin'ny DARS-AS1 shRNA (sary 4d sy Fig. 4a fanampiny).Thapsigargin dia adin-tsaina ER izay mahatonga ny ER hamoaka Ca2 +.Ny fitsaboana amin'ny thapsigargin dia voalaza fa miteraka ny fanehoana sy ny fampahavitrihana ny PACT, izay mifandray bebe kokoa sy manetsika ny PKR, izay mitarika ho amin'ny apoptose amin'ny fampitomboana ny eIF2α phosphorylation 18,61.Eto izahay dia nampiasa thapsigargin ho toy ny stimulator ny lalana PACT/PKR hanadihady raha afaka manampy ny sela handresy ny adin-tsaina ny DARS-AS1 amin'ny fanakanana ny lalana PACT/PKR.Hitanay fa ny haavon'ny fitenenana DARS-AS1 dia mifandray tsara amin'ny fanoherana ny sela amin'ny thapsigargin.Ny sela SW620 izay maneho ny DARS-AS1 dia tafavoaka tsara kokoa rehefa notsaboina tamin'ny thapsigargin, raha toa kosa ny cellules miaraka amin'ny DARS-AS1 knockdown dia nanjary mora kokoa (sary 4e).Mifanaraka amin'ireo valiny ireo, ny overexpression DARS-AS1 dia nampihena ny phosphorylation PKR thapsigargin (fanampiny sary 4b).Mifanohitra amin'izany kosa, taorian'ny fitsaboana thapsigargin, ny PKR sy ny eIF2α dia phosphorylated amin'ny haavo avo kokoa ao amin'ny cellule knockdown DARS-AS1 raha oharina amin'ny sela mifehy (Fig. 4b fanampiny).Mahaliana fa ny thapsigargin dia nampirisika ny fanehoana DARS-AS1 amin'ny fomba miankina amin'ny doka, izay mety manondro ny fiasan'ny DARS-AS1 (fanampiny 4c).Fanampin'izay, nanao fitiliana fampahavitrihana in vitro izahay mba hanamafisana ireo fanamarihana ireo.Raha fohifohy, ny PKR dia nodiovina tamin'ny lysates sela tamin'ny fampiasana antibody anti-PKR, avy eo dia nodiovina tamin'ny PACT recombinant sy DARS-AS1 nosoratana in vitro.Taorian'ny fanehoan-kevitra enzymatic, ny phospho-PKR dia hita tamin'ny fampiasana WB.Ny valiny dia nanondro fa ny phosphorylation PKR dia nosakanan'ny DARS-AS1, fa tsy tamin'ny fanaraha-maso RNA (sary 4f).Ireo vokatra in vitro sy in vivo ireo dia milaza fa ny DARS-AS1 dia manakana ny fampahavitrihana PKR-mediated PACT.Nandritra izany fotoana izany, dia nahatsikaritra ihany koa ny fihenan'ny fanarenana PACT teo anatrehan'ny DARS-AS1 (sary 4f).Ity vokatra ity dia mifanaraka amin'ny valin'ny fitiliana proteinina in vitro (sary 4c) ary mampiseho indray ny asan'ny fanakanana ny DARS-AS1 ho an'ny fikambanana PACT-PKR.
Ser246 sy Ser287 ao amin'ny sehatra D3 an'ny PACT dia takiana amin'ny fampahavitrihana PKR eo ambanin'ny adin-tsaina.Ny fanoloana ny sisa tavela amin'ny alanine roa dia nanome PACT mutant (mutD), izay nanetsika ny PKR raha tsy nisy ny adin-tsaina, ary ny fanoloana ny alanine (mutA) dia namadika ny protocol.Koa satria nasehonay ny maha-zava-dehibe an'io sehatra io amin'ny fifandraisana mivantana amin'ny DARS-AS1, dia namorona ireo mutant PACT roa ireo izahay mba hitsapana raha mety ho tafiditra amin'ny fifandraisana amin'ny DARS-AS1 ihany koa ireo sisa tavela ireo.Mahaliana fa samy very ny fahafahana mamatotra amin'ny DARS-AS1 (Fig. 4d fanampiny) ny mutants, izay manoro hevitra fa ny rafitra feno amin'ny proteinina PACT dia mety takiana amin'ny fifandraisana mahomby amin'ny DARS-AS1.
Ankoatr'izay, ny valiny dia manoro hevitra ihany koa fa ny fampihenana ny fihanaky ny sela vokatry ny DARS-AS1-shRNA dia azo averina amin'ny ampahany amin'ny alàlan'ny fanerena tafahoatra ny PACT mutant ratsy (PACTmutA) na ny mutant PKR (PKRmut) (Fanampiana fanampiny 4e. e).Ny fihoaram-pefy amin'ny mutant PKR manjakazaka dia nampihena ny phosphorylation PKR nateraky ny famotehana DARS-AS1 ary koa ny phosphorylation eIF2α amin'ny sela tsy misy serum (sary 4g).Ny tena zava-dehibe dia nihena ihany koa ny ampahany amin'ny sela apoptotika vokatry ny fandondonana DARS-AS1 tao amin'ny cellule overexpressing PKRmut (sary 4h sy sary fanampiny 4g).Ny fanakanana ny asan'ny PKR kinase koa dia manimba ny asan'ny DARS-AS1, satria ny vokatra dia naneho fa ny fihenan'ny DARS-AS1 dia mahalana no nahatonga ny phosphorylation PKR sy eIF2α rehefa notsaboina tamin'ny inhibitor C16 manokana ny PKR (sary 4i sy fanampiny 4h).).Raha atambatra, ny valiny dia manoro hevitra fa ny DARS-AS1 dia mampiroborobo ny fihanaky ny sela, farafaharatsiny amin'ny ampahany, amin'ny fanakanana ny fampahavitrihana PKR-mediated PACT.
Mba hijerena bebe kokoa ny anjara asan'ny DARS-AS1 amin'ny tumorigenesis, dia nanao fanandramana vivo izahay tamin'ny fampiasana modely xenograft totozy. Ny vokatra dia mampiseho fa ny fihenan'ny DARS-AS1 dia nihena be ny fitomboan'ny tumor amin'ny totozy (p value <0.0001) (sary 5a). Ny vokatra dia mampiseho fa ny fihenan'ny DARS-AS1 dia nihena be ny fitomboan'ny tumor amin'ny totozy (p value <0.0001) (sary 5a). Результати показывают, что нокдаун DARS-AS1 резко снижает рост опухоли у мышей (значение p <0,0001) (рис. 5а). Ny valiny dia mampiseho fa ny fihenan'ny DARS-AS1 dia mampihena be ny fitomboan'ny fivontosana amin'ny totozy (p value <0.0001) (sary 5a).结果表明，DARS-AS1 的敲低显着降低了小鼠的肿瘤生长（p 值< 0.0001）（图5a）。结果表明，DARS-AS1 的敲低显着降低了小鼠的肿瘤生长（p值<0.0001）（图5a）。 Результати показали, что нокдаун DARS-AS1 значительно снижает рост опухоли у мышей (значение р <0,0001) (рис. 5а). Ny valiny dia naneho fa ny fihenan'ny DARS-AS1 dia mampihena be ny fitomboan'ny fivontosana amin'ny totozy (p value <0.0001) (sary 5a).Noho izany, tao amin'ny vondrona knockdown DARS-AS1, dia nisy fihenam-bidy lehibe teo amin'ny habetsaky ny fivontosana eo amin'ny 72.9% ary ny haben'ny tumora eo amin'ny 87.8% (sary 5b-d).Ireo valiny ireo dia manoro hevitra mafy fa ny DARS-AS1 dia afaka mampiroborobo ny fitomboan'ny fivontosana amin'ny vivo.
Ny fiantraikan'ny doka DARS-AS1 amin'ny oncogenesis colorectal amin'ny totozy miboridana.Ny curves (a), ny haben'ny tumor (b), ny lanjany (c), ary ny sarin'ny tumor (d) dia aseho.Ny barana diso dia maneho ± SEM. n = 10. ****p < 0.0001, amin'ny fitsapana t an'ny mpianatra roa rambo. n = 10. ****p < 0.0001, amin'ny fitsapana t an'ny mpianatra roa rambo. n = 10. ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. n = 10. ****p < 0.0001 t-test an'ny mpianatra roa rambo.n = 10. ****p < 0.0001，通过双尾学生t 检验。 ****p < 0.0001，通过双尾学生t检验。 ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. ****p <0.0001 t-test an'ny mpianatra roa rambo.e Kaplan-Meier dia nandinika ny fifandraisana misy eo amin'ny haavon'ny fitenenana DARS-AS1 sy ny fahaveloman'ny marary amin'ny UVM, KICH, KIRP, MESO, GBM, ary LGG.Ny haavon'ny fanehoana DARS-AS1 amin'ny marary dia ao amin'ny 50% ambony;ny haavon'ny fitenenana DARS-AS1 amin'ny marary dia eo amin'ny 50% ambany.Ny p-values ​​dia nofaritana tamin'ny alàlan'ny fitsapana ny laharana log.f Modely atolotra izay ny DARS-AS1 dia mifehy ny lalan'ny PACT-PKR sy ny fitomboan'ny fivontosana.
Mba hahatakarana bebe kokoa ny fiantraikan'ny klinika amin'ny DARS-AS1, dia nandinika ny fifandraisana misy eo amin'ny fiteniny sy ny fahaveloman'ny marary izahay.Tamin'ny famakafakana ny angon-drakitra TCGA dia hitanay fa ny fanehoana DARS-AS1 avo kokoa dia mifandray amin'ny uveal melanoma (UVM), chromophobia renal (KICH), kanseran'ny sela papillary renal (KIRP), mesothelioma (MESO), multiplex.Ny fahavelomana ambany kokoa dia misy ifandraisany amin'ny glioblastoma morphosis (GBM) sy ny marary manana glioma atidoha ambany (LGG) (sary 5e).Ireo vokatra ireo dia manondro fa ny DARS-AS1 dia mety mitana anjara toerana lehibe amin'ny fivoaran'ny fivontosana klinika ary mety ho biomarker mety hitranga amin'ny homamiadana marobe.
Amin'ity fandalinana ity, amin'ny fampiasana screening functional CRISPRi lehibe, dia nanapa-kevitra izahay fa ny DARS-AS1 lncRNA dia mandresy ny adin'ny sela homamiadana amin'ny alàlan'ny fanaraha-maso ireo mpamaly adin-tsaina roa, PACT sy PKR.Amin'ny fifandraisana mivantana amin'ny PACT, ny DARS-AS1 dia nanakana ny fampahavitrihana PKR-mediated PACT, ka nanakana ny fahafatesan'ny sela apoptotika sy ny fampiroboroboana ny fihanaky ny sela (sary 5f).Ny fampivoarana ny DARS-AS1 dia voamarika amin'ny karazana homamiadana maro, izay manoro hevitra fa ny asany amin'ny fampiroboroboana ny fahaveloman'ny sela homamiadana ao anatin'ny toe-javatra mampitebiteby dia mety azo ampiharina amin'ny karazana homamiadana maro.
Ny PACT dia fantatra fa proteinina mpikatroka PKR, ary ny fampahavitrihana PKR an'ny PACT dia manana anjara toerana lehibe amin'ny valin'ny adin-tsaina amin'ny alàlan'ny fifehezana ny fandikana, fandikana, apoptose, ary ny fizotran'ny sela manan-danja62.Nandritra ny am-polony taona maro, ny fanandramana dia natao mba hahatakarana ny fitsipika momba ny homamiadan'ny PACT-PKR cascade.Eto, ny fandinihanay dia nanambara fomba hafa mifehy ny PACT-PKR amin'ny sela homamiadana amin'ny alàlan'ny lncRNA DARS-AS1, izay mifatotra mivantana amin'ny PACT, manakana ny fifandraisana PACT-PKR, manakana ny fampahavitrihana PKR sy ny phosphorylation eIF2α, ka manakana ny apoptose vokatry ny adin-tsaina ary mandrisika ny fihanaky ny homamiadana amin'ny farany.sela.Ity fikarohana ity dia manazava ny mety ho kendrena lncRNA ho an'ny vinavina sy fitsaboana homamiadana.
Ny angon-drakitray dia naneho fa ny fandoroana ny DARS-AS1 dia mahatsikaritra ny sela amin'ny hanoanana serum miaraka amin'ny fitomboana lehibe amin'ny PKR sy ny eIF2α phosphorylated.Ireo valiny ireo dia manoro hevitra fa ny DARS-AS1 dia mampiroborobo ny fahaveloman'ny sela homamiadana ao anatin'ny fepetra henjana amin'ny alàlan'ny fanakanana ny hetsika PACT / PKR.Maro ny RNA tsy misy kaody hafa, toy ny ASPACT sy nc886, dia tafiditra ao amin'ny axis PACT/PKR amin'ny alàlan'ny fampihenana ny mRNA PACT48 na ny fifehezana ny autophosphorylation amin'ny alàlan'ny fatorana amin'ny PKR49,50,64.Anisan’izany ny DARS-AS1 manakorontana ny fikambanana PACT-PKR.Ity fandalinana ity dia manatsara ny fahatakarantsika ny fitsipiky ny axe PACT/PKR sy ny andraikitry ny lncRNA amin'ny valin'ny adin-tsaina.
Ny PACT dia misy sehatra telo samihafa.Ny tsirairay amin'ireo dsRBDs roa voalohany dia ampy hahatratrarana ny fifamatorana ambony amin'ny PACT amin'ny PKR, raha ny sehatra fahatelo (D3) kosa dia takiana amin'ny fampahavitrihana PKR in vitro sy in vivo.Ny fandinihanay dia naneho fa ny DARS-AS1 dia mifandray amin'ny sehatra D3 (sary 3h).Raha jerena ny haben'ny lncRNA (768 nucleotides), ny DARS-AS1 mifamatotra amin'ny D3 dia afaka manakana ara-batana ny fifandraisana eo amin'ny sehatra PACT an'ny dsRBD sy PKR, ka manakana ny fikambanan'ny PACT sy PKR.Ny fiovan'ny teboka PACT izay nisolo ny Ser246 sy Ser287 ao amin'ny D3 miaraka amin'ny alanine na aspartate dia nanelingelina ny fifandraisany amin'ny DARS-AS1, manondro ny maha-zava-dehibe ny fananana ara-drafitra sy elektrika amin'ny D3 amin'ny fikambanany.Ny antsipiriany bebe kokoa momba an'io mekanika io dia takiana amin'ny ho avy, amin'ny fampiasana famakafakana biochemika mazava kokoa sy famakafakana ara-drafitra PACT avo lenta.
Ny fanadihadiana teo aloha dia nitatitra fa ny DARS-AS1 dia mampiroborobo ny fihanaky ny sela amin'ny alàlan'ny mekanika maromaro51,52,53.Ao amin'ny ohatra iray, ny mpanao fanadihadiana dia nanamarika fa ny DARS-AS1 dia nanatsara ny fototarazony DARS proteinina antisense amin'ny alàlan'ny mikendry ny miP-194-5p amin'ny sela homamiadan'ny voa.Na izany aza, tamin'ity fanadihadiana ity, ny fandoroana DARS-AS1 dia tsy nisy fiantraikany firy tamin'ny fandikana DARS tamin'ny karazana homamiadana maro, anisan'izany ny homamiadan'ny koloro, ny nono ary ny aty.Satria ny lncRNAs dia mampiseho endrika fanehoana manokana amin'ny sela sy ny sela, ny mekanika miasa dia mety tsy ho voatahiry amin'ny karazana homamiadana, izay mety hanampy amin'ny tsy fitovizan'ny fandinihanay sy ny fanombanana teo aloha momba ny homamiadana samihafa.Ilaina ny fandalinana manokana mba hanazavana ny fomba fiasa manokana amin'ny fizotry ny physiologique sy pathologique isan-karazany.
Ny fanadihadiana momba ny angon-drakitra momba ny klinika dia naneho fa ny fitenenana DARS-AS1 amin'ny tumors dia mifamatotra amin'ny fahaveloman'ny mararin'ny homamiadana, izay manasongadina ny maha-zava-dehibe ny axis DARS-AS1 / PACT / PKR amin'ny prognosis homamiadana.Ho fehin-kevitra, ny fandinihanay dia mampiseho fa ny DARS-AS1 dia mpandrindra ny PACT/PKR famantarana famantarana, mampiroborobo ny fihanaky ny sela homamiadana, ary manakana ny apoptose mandritra ny valin'ny adin-tsaina, izay manome tsipika fikarohana hafa ary mahaliana ny fikarohana ho avy amin'ny fitsaboana mety. .
Ny tsipika selan'olombelona SW620, A549, MBA-MD-231, HCT116, HepG2 ary HEK293T dia azo avy amin'ny National Cell Line Resource Infrastructure ao Shina.Ny sela rehetra dia voatazona ao amin'ny medium DMEM (DMEM, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) nampiana 10% FBS (Gemini, Brooklyn, NY) ary 1% penicillin-streptomycin (Thermo Fisher Scientific) amin'ny 37 ° C, 5% CO2.incubator.
Anti-PACT, Abcam (ab31967);Anti-PKR, Abcam (ab184257);Anti-PKR (phospho-T451), Abcam (ab81303);Anti-Flag, Abcam (ab125243);Anti-eIF2α, Abcam (A0764));anti-eIF2α (phosphorus S51), Abcam (ab32157);anti-PACT (phosphorus S246), Abgent (AP7744b);anti-β-tubulin, CST (2128);totozy mahazatra IgG, CST (5415S);bitro mahazatra IgG, CST (2729S).Ny antibiôsy dia natsipy 1: 1000 tao amin'ny PBST ho an'ny famafazana tandrefana ary 1: 100 ho an'ny IP.
Ny sgRNA dia novolavolaina tamin'ny alalan'ny fitaovana ampahibemaso antsoina hoe CRISPR-ERA66.Nampiasa ny mari-pamantarana fitaovana ampiasaina ho an'ny fivoaran'ny sgRNA izahay ary ny algorithm nokajiana ny tranokala mamatotra sgRNA ao amin'ny faritra 3 kb.miorina ao amin'ny TSS.Ny dobo misy oligonucleotides sgRNA dia novolavolaina tao amin'ny CustomArray, Inc. (Bothewell, WA) ary natambatra ho plasmids pgRNA olombelona (Addgene #44248).Ny totalin'ny 12 µg pgRNA plasmid, 7.2 µg an'ny psPAX2 (Addgene #12260), ary 4.8 µg an'ny pMD2.G (Addgene #12259) dia nafindra tao amin'ny 5 x 106 HEK293T dishes amin'ny 106 HEK293T. cellule ( CWBIO, Beijing, Shina) manaraka ny torolalan'ny mpanamboatra.Ny supernatant misy viriosy dia nangonina 48 sy 72 ora taorian'ny fifindrana ary voasivana tamin'ny sivana 0,45 µm.Ho an'ny fitiliana, ny sela SW620 maneho ny proteinina fusion dCas9 / KRAB dia azo avy amin'ny famindrana viriosy.Ny sela SW620 novaina dia voan'ny viriosy tao amin'ny fanandramana otrikaretina tsy miankina efatra tao amin'ny MOI 0.1-0.3 ary nalaina tamin'ny 2 μg / ml puromycin (Sigma, St. Louis, MO) nandritra ny 2 andro.Taorian'izay, ny sela dia nokolokoloina nandritra ny 18 andro in vitro miaraka amin'ny fandrakofana tranomboky kely indrindra amin'ny sela 500 / sgRNA ho an'ny fitiliana.
Ny ADN génomika dia nalaina araka ny torolalan'ny QIAamp DNA Blood Midi Kit (QIAGEN, Düsseldorf, Alemaina; 51183).Raha atambatra, 100 μg ny ADN génomika isaky ny famerenana biolojika no nampiasaina hanamboarana ny tranomboky.Ny faritra sgRNA dia nohamafisin'ny PCR roa ary nampifandraisina tamin'ny barcode.
Ny vokatra PCR dia nodiovina tamin'ny alàlan'ny gel NucleoSpin® sy kitapo fanadiovana PCR (MACHEREY-NAGEL, Düren, Alemaina; 740609.250) ary nohamarinina tamin'ny alàlan'ny kitapom-pandrefesana ADN misy tady roa Qubit™ HS (Thermo Fisher Scientific; Q32854).
Ny fitiliana MTS dia nampiasaina mba handrefesana ny fiparitahan'ny sela.Ny sela dia nafafy tamin'ny takelaka 96-lavaka amin'ny hakitroky voalohany amin'ny sela 2000 / lavadrano.Ny isan'ny sela dia refesina isan'andro amin'ny fotoana voalaza mandritra ny 4-6 andro.Ho an'ny lavadrano tsirairay, ny 20 μl ny MTS reagent (Promega) dia nopotehina tamin'ny 100 μl ny DMEM, natsofoka tamin'ny sela nandritra ny 4 ora tamin'ny 37 ° C, ary avy eo norefesina ny OD490.
Hita tamin'ny famakafakana ny fiforonan'ny spheres ny fahafahan'ny fitomboana tsy voafehy.Raha fohifohy, ny sela 2000 nafindra tamin'ny shRNA DARS-AS1 na ny shRNA fanaraha-maso dia novolavolaina tamin'ny microplate ambany ambany (Corning) miaraka amin'ny fiovana antonony isaky ny 4 andro.Noisaina ny spheroids rehefa afaka 14 andro.Ny sela 500 nafindra niaraka tamin'ny plasmid overexpression DARS-AS1 na ny plasmid fanaraha-maso dia nampiasaina ho an'ny fanatsarana, raha tsy izany dia tsy niova ny fomba.
Ny RNA dia nadika tamin'ny fampiasana T7 RNA polymerase sy biotin-16-UTP (Roche 1138908910) araka ny torolalan'ny Riboprobe® Combination Systems (Promega P1440).Ireo primer ampiasaina eto dia voatanisa ao amin'ny tabilao fanampiny 4.
Ny faritra misy proteinina PACT na PKR dia natambatra ho pET15b (Addgene #73619) ary niova ho BL21 (DE3).Ny bakteria dia natsofoka nandritra ny alina tao amin'ny LB nomena ampicillin ary avy eo natsofoka 100 heny tamin'ny LB vaovao.Rehefa nahatratra 0.8 ny OD600 an'ny medium, dia nampiana 1 mM IPTG mba hamporisihana ny fanehoana proteinina.Taorian'ny incubation mandritra ny alina miaraka amin'ny fihovitrovitra malefaka (250 rpm amin'ny 20 ° C), ny pellet sela dia nangonina tamin'ny centrifugation (4000 rpm, 10 min, 4 ° C).Avereno indray ny pellet sela ao anaty buffer lysis (50 mM Tris, pH 8.0, 250 mM NaCl, 1 mM PMSF) ary atsipazo amin'ny ranomandry mandritra ny 30 min, avy eo sonicate (15 min, 5 s on/off, on ice) ary centrifuge (13,000). rpm)., 30 min, 4°C).Ny supernatant dia nampidirina tao amin'ny resin'ny Ni-NTA (QIAGEN) in-3 tamin'ny 4 ° C, nosasana in-4 tamin'ny buffer wash (50 mM Tris, pH 8.0, 40 mM imidazole, 250 mM NaCl) ary nesorina in-3, miaraka amin'ny totaliny. amin'ny buffer eluent 10 ml (50 mM Tris, pH 8.0, 250 mM NaCl, 300 mM imidazole).Ny proteinina voadio dia nofaritana tamin'ny fampiasana WB ary ny fifantohana dia nofaritana tamin'ny alàlan'ny kitapom-panadinana proteinina Qubit™ (Thermo Fisher Scientific; Q 33212).
Ny RIP assays dia natao araka ny voalaza teo aloha, miaraka amin'ny fanovana.Fohy, 1x RIP buffer (25 mM Tris-HCl, pH 7.5, 100 mM NaCl, 0.5% NP-40, RNasin ribonuclease inhibitor (Promega), PMSF (Beyotime Biotechnology), 1 mM DDM, protease) lyses cytostatic 1 x 107 cocktail (Roche, 1 mM DTT) ary centrifuge amin'ny 13,000 rpm mandritra ny 15 minitra amin'ny 4 ° C.Ny supernatant avy eo dia natsofoka tamin'ny proteinina A + G magnetic vakana (Millipore) mifamatotra amin'ny 5 μg anti-PACT antibody (Abeam) na IgG (CST).Ny vakana dia nosasana in-5 tamin'ny buffer 5x RIP, avy eo levonina amin'ny proteinase K (NEB).Ny RNA dia nalaina tamin'ny Trizol ary nofaritan'ny RT-qPCR.Ny voalohany dia aseho ao amin'ny tabilao fanampiny 5.
Ny in vitro RIP assay dia natao araka ny protocol RIP assay novaina.Ny totalin'ny 5 pmol amin'ny in vitro transcribed RNA dia nodiovina 1x tamin'ny buffer RIP ary nalaina tamin'ny incubation tamin'ny 65 ° C nandritra ny 5 minitra arahin'ny fampangatsiahana miadana mankany amin'ny mari-pana.Ny totalin'ny 5 pmol amin'ny proteinina PACT tsy misy dikany na mutated sainam-pirenena dia nodiovina tamin'ny E. coli.Atsofohy miaraka amin'ny RNA efa nohavaozina mandritra ny 2 ora amin'ny 4 ° C ary araho ny dingana etsy ambony ho an'ny famakafakana RIP ho an'ny IP anti-flag.
Ho an'ny famakafakana fanitarana ny RNA, ny sela 1 × 107 dia nalaina tamin'ny buffer 1xRIP.Taorian'ny centrifugation tamin'ny 13,000 rpm nandritra ny 15 min tamin'ny 4 ° C, ny supernatant dia nokarakaraina tamin'ny 30 μl streptavidin magnetic vakana (Beckman) nandritra ny 2 ora tamin'ny 4 ° C.Ny lysate voadio dia nomena tRNA masirasira ary nampidirina tamin'ny 40 pmol an'ny RNA renatured mandritra ny alina amin'ny 4 ° C, avy eo mandritra ny adiny 2 hafa ary 20 μl ny vakana magnetika streptavidin vaovao voasakana amin'ny BSA dia nampiana.Ny dingana fanasana dia in-4 tamin'ny buffer 5x RIP ary in-4 tamin'ny buffer RIP 1x.Ny proteinina mifanaraka amin'izany dia nopotehina tamin'ny buffer biotin elution (25 mM Tris-HCl, pH 7.5, 12.5 mM D-biotin, PMSF) ary nisaraka tamin'ny NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel (Invitrogen).Taorian'ny fandokoana volafotsy (Beyotime Biotechnology), dia nesorina sy nodinihin'ny MS ny tarika sasany.
Ny famakafakana Co-IP dia natao mba hitsapana ny fifandraisan'ny PACT sy PKR.Raha fohifohy, ny lysate supernatant dia nomanina tamin'ny fampidirana sela lysed 1 x 107 ao anaty buffer 1 x RIP arahin'ny centrifugation amin'ny 13,000 rpm mandritra ny 15 minitra amin'ny 4 ° C.Ny lysates dia feno proteinina A + G magnetika vakana, mifamatotra amin'ny 5 µg antibody anti-PACT, ary mihodina moramora mandritra ny alina amin'ny 4 ° C.Ny vakana dia nosasana in-3 tamin'ny 5 × RIP buffer, indroa tamin'ny 1 × RIP buffer ary nodiovina tamin'ny 1 × SDS buffer.Ny proteinina sitrana dia nodinihina tamin'ny gel SDS-PAGE ary hitan'ny WB.
Ny roa pmol PACT misy saina sy 1 pmol ny PKR dia nodiovina tamin'ny E. coli.Alefaso amin'ny buffer 1 × RIP ary atsipazo miaraka amin'ny 10 pmol amin'ny ARN efa nohavaozina mandritra ny 2 ora amin'ny 4 ° C.Taorian'izay, dia nodidiana tamin'ny proteinina A + G magnetic bead-conjugated anti-labeled antibody mandritra ny adiny roa fanampiny.Ny vakana dia nosasana in-efatra tamin'ny buffer 1x RIP ary nopotehina tamin'ny buffer 1x SDS.Ny vokatra PACT sy PKR dia hitan'ny WB.