NEWS

Misaotra anao nitsidika ny Nature.com.Ny kinova browser ampiasainao dia manana fanohanana CSS voafetra.Mba hahazoana traikefa tsara indrindra, manoro hevitra anao izahay hampiasa navigateur nohavaozina (na esory ny Compatibility Mode amin'ny Internet Explorer).Mandritra izany fotoana izany, mba hiantohana ny fanohizana ny fanohanana, dia hanolotra ny tranokala tsy misy fomba sy JavaScript izahay.
Ny fomba fametahana ny enzymatic akaiky dia mifototra amin'ny estera mavitrika na radika phenoxy dia ampiasaina betsaka amin'ny sarintany ny proteomes subcellular sy ny fifandraisana proteinina amin'ny sela velona.Na izany aza, ny estere mavitrika dia tsy dia mihetsika loatra, ka miteraka radius marika midadasika, ary ny radical phenoxy vokatry ny fitsaboana peroxyde dia mety hanelingelina ny lalana redox.Eto izahay dia mitatitra ny fomba fametahana marika miankina amin'ny photoactivation (PDPL) novolavolaina tamin'ny fampifandraisana ny proteinina miniSOG photosensitizer amin'ny proteinina mahaliana.Nateraky ny hazavana manga sy voafehin'ny fotoana fiposahan'ny masoandro, ny oksizenina singlet dia avoaka ary avy eo dia tratra ny fametahana ny sisa tavela amin'ny histidine amin'ny alàlan'ny fikarohana aniline.Asehontsika ny fahatokiany ambony amin'ny alalan'ny sarintany proteome manokana organelle.Ny fampitahana mifanila amin'ny PDPL miaraka amin'ny TurboID dia mampiseho fandrakofana proteomika manokana sy feno momba ny PDPL.Avy eo, nampihatra ny PDPL izahay tamin'ny coactivator transcriptional BRD4 sy E3 Parkin ligase mifandray amin'ny aretina ary nahita mpandray anjara tsy fantatra taloha.Amin'ny alàlan'ny screening overexpression, ny substrate roa tsy fantatra, Ssu72 sy SNW1, dia fantatra ho an'i Parkin, izay ny fanimbana dia nanelanelana ny lalana ubiquitination-proteasome.
Mifototra amin'ny fizotran'ny sela fototra maro ny famaritana marina ny tambajotra proteinina.Noho izany, ny sarintany spatiotemporal tena marina momba ny fifandraisan'ny proteinina dia hanome fototra molekiola amin'ny famaritana ny lalan'ny biolojika, ny patolojia amin'ny aretina, ary ny fanakorontanana ireo fifandraisana ireo ho an'ny tanjona fitsaboana.Mba hanaovana izany, dia tena ilaina ny fomba ahafahana mamantatra ny fifandraisana ara-nofo ao amin'ny sela na sela velona.Ny Affinity Purification Mass Spectrometry (AP-MS) dia nampiasaina ara-tantara mba hamantarana ireo mpiara-miombon'antoka amin'ny proteinina mahaliana (POI).Miaraka amin'ny fampandrosoana ny fomba proteomika quantitative dia noforonina ny Bioplex3.0, ny angon-drakitra lehibe indrindra amin'ny tambajotra proteinina mifototra amin'ny AP-MS.Na dia tena mahery vaika aza ny AP-MS, ny lysis sela sy ny dilution dingana ao amin'ny workflow dia mitongilana mankany amin'ny fifandraisana malemy sy mandalo ary mampiditra artifacts post-lysis toy ny mpivady fifandraisana sandoka izay tsy manana compartmentalization alohan'ny lysis.
Mba hamahana ireo olana ireo, dia novolavolaina ny asidra amino tsy voajanahary (UAA) miaraka amin'ny vondrona mifamatotra sy ny sehatra enzymatic eo akaikiny (PL) (ohatra APEX sy BioID)5.Na dia nampiharina tamim-pahombiazana tamin'ny toe-javatra maro aza ny fomba UAA ary manome fampahalalana momba ny adhesive proteinina mivantana, dia mbola ilaina ny fanatsarana ny tranokala fampidirana UAA.Ny tena zava-dehibe dia fomba fametahana stoichiometric izay tsy misy fihemorana catalytic amin'ny hetsika fametahana marika.Mifanohitra amin'izany kosa, ny fomba enzymatic PL, toy ny fomba BioID, dia mampifandray ny ligase biotin novolavolaina amin'ny POI7, izay manetsika ny biotine avy eo mba hamorona mpanelanelana ester biotinyl-AMP.Ny anzima noho izany dia manangana sy mamoaka "rahona" biotine mavitrika izay manisy marika ny sisa tavela amin'ny lysine proximal.Na izany aza, ny BioID dia mitaky ora 12 mahery mba hahazoana mari-pamantarana misy marika ampy, izay manakana ny fampiasana azy amin'ny fanapahan-kevitra ara-potoana.Amin'ny fampiasana evolisiona mivantana mifototra amin'ny fampisehoana leviora, TurboID dia natao mifototra amin'ny BioID mba hahomby kokoa, ahafahan'ny marika mahomby miaraka amin'ny biotine ao anatin'ny 10 minitra, mamela ireo dingana mavitrika kokoa hianarana.Satria ny TurboID dia tena mavitrika ary ny haavon'ny biotin endogenous dia ampy ho an'ny fametahana marika ambany, ny fametahana background dia lasa olana mety hitranga rehefa ilaina ny fanamafisam-peo avo lenta sy ara-potoana amin'ny fanampiana biotin exogenous.Ankoatr'izay, ny estere mavitrika dia tsy mihetsika loatra (t1 / 2 ~ 5 min), izay mety hitarika amin'ny radius marika lehibe, indrindra aorian'ny saturation ny proteinina mifanakaiky amin'ny biotin 5. Amin'ny fomba hafa, ny fifangaroan'ny génétique amin'ny ascorbate peroxidase (izany hoe biotin- phenol radicals ary mamela ny fametahana proteinina ao anatin'ny iray minitra9,10. Ny APEX dia ampiasaina betsaka hamantarana ny proteôma subcellular, ny komples proteinina membrane, ary ny complexe proteinina cytosolic signaling11, 12. Na izany aza, ny filana ny peroxide avo lenta dia mety hisy fiantraikany amin'ny proteinina na ny lalana redox, manakorontana. fizotry ny sela.
Noho izany, fomba iray vaovao afaka mamokatra karazana famoretana misy marika-radius mavitrika kokoa miaraka amin'ny fahitsiana ara-potoana sy ara-potoana avo lenta nefa tsy manelingelina ny lalan'ny sela dia ho fanampim-baovao lehibe amin'ny fomba efa misy. Anisan'ireo karazana mihetsiketsika, ny oksizenina singlet dia nanaitra ny saintsika noho ny androm-piainany fohy sy ny radius diffusion voafetra (t1 / 2 < 0.6 µs amin'ny sela)13. Anisan'ireo karazana mihetsiketsika, ny oksizenina singlet dia nanaitra ny saintsika noho ny androm-piainany fohy sy ny radius diffusion voafetra (t1 / 2 < 0.6 µs amin'ny sela)13. Среди активных форм наше внимание привлек синглетный кислород из-за его короткого времени жизни и ограгнически и ограгнический кислород из-за его короткого времени жизни и ограгнически, 6 мендиф. Anisan'ireo endrika mavitrika, nisarika ny saintsika ny oksizenina singlet noho ny androm-piainany fohy sy ny radius diffusion voafetra (t1 / 2 <0.6 µs amin'ny sela)13.在活性物质中，单线态氧因其寿命短和扩散半径有限（细胞中t1/2 < 0.6 µs）说是他们我们一一么起中可耶和华。 1/2 < 0.6 µs）而引起了我们的注意13 Среди активных форм наше внимание привлекает синглетный кислород из-за его короткого времени жизни и ограница и ограница и ограница и ограница 1/2 хифкдный. Amin'ireo endrika mavitrika, ny oksizenina singlet dia misarika ny saintsika noho ny androm-piainany fohy sy ny radius diffusion voafetra (t1 / 2 < 0,6 μs amin'ny sela).Ny oxygène singlet dia voalaza fa manimba ny methionine, tyrosine, histidine ary tryptophan, ka mahatonga azy ho polar 14,15 ho an'ny fametahana amine na thiol mifototra amin'ny probes16,17.Na dia nampiasaina aza ny oksizenina singlet mba hanoratana ny RNA ao amin'ny faritra subcellular, dia mbola tsy voamarika ny paikady hamerenana ireo marika akaiky POI endogenous.Eto izahay dia manolotra sehatra iray antsoina hoe photoactivation-dependent proximity labeling (PDPL), izay ampiasanay jiro manga hanazavana ny POI mitambatra amin'ny miniSOG photosensitizer ary mandrisika ny famokarana oksizenina singlet mba hanamafisana ny sisa tavela, arahin'ny fanovana misy amine mba hanamafisana ny probes simika ao anaty. sela velona mpanelanelana..Nanandrana vondrona probe simika izahay mba hanamafisana ny mari-pamantarana marika ary hamantatra ny tranokala fanovana amin'ny alàlan'ny workflows proteomika misokatra.Ny fampitahana mifanila amin'ny PDPL miaraka amin'ny TurboID dia mampiseho fandrakofana proteomika manokana sy feno momba ny PDPL.Nampiharinay io fomba fiasa io amin'ny marika manokana amin'ny organelle amin'ny proteome subcellular sy ny famantarana ny proteinina ankapobeny ny mpiara-miombon'antoka ho an'ny proteinina mifehy ny epigenetika mifandraika amin'ny homamiadana BRD4 sy ny E3 ligase Parkin mifandraika amin'ny aretina Parkinson, izay nanamafy ny tambajotra proteinina fantatra sy tsy fantatra. fifandraisana..Ny fahafahan'ny PDPL hamantatra ny substrate E3 amin'ny complexe proteinina lehibe dia maneho toe-javatra iray izay ilana ny fanekena ny binder ankolaka.Ny substrate parkin roa tsy fantatra navoakan'ny ubiquitination-proteasome dia nohamafisina in situ.
Photodynamic therapy (PDT) 19 sy chromophore-assisted laser inactivation (CALI) 20, izay ahafahan'ny taratra hazavana miaraka amin'ny photosensitizers miteraka oksizenina singlet, dia afaka manafoana ny proteinina kendrena na miteraka fahafatesan'ny sela.Satria ny oksizenina singlet dia akora mihetsiketsika be miaraka amin'ny halaviran'ny diffusion teorika eo amin'ny 70 nm eo ho eo, azo fehezina ny oxidation voafetra ara-potoana manodidina ny photosensitizer.Mifototra amin'io foto-kevitra io, nanapa-kevitra ny hampiasa oksizenina singlet izahay mba hahazoana marika akaiky ny proteinina complexes ao amin'ny sela velona.Namolavola fomba fiasa chemoproteomic PDPL izahay mba hanatanterahana asa efatra: (1) mba hanamafisana ny famokarana oksizenina singlet mavitrika mitovy amin'ny fomba fiasa enzymatic PL;(2) manome mari-pamantarana voavaha amin'ny fotoana rehefa manomboka maivana;(3) amin'ny alalan'ny fanovana (4) Fadio ny mampiasa cofactors endogenous (toy ny biotine) mba hampihenana ny fiaviana, na mampiasa reagents exogenous be korontana (toy ny peroxyde) mba hampihenana ny fihanaky ny sela amin'ny adin'ny tontolo iainana.
Ny photosensitizers dia azo zaraina ho sokajy roa ao anatin'izany ny fluorophores kely lanja molekiola (ohatra ny raozy bengal, manga methylene)22 sy ny proteinina kely voafandrika (oh miniSOG, KillerRed)23.Mba hahatratrarana ny famolavolana modular dia namolavola ny sehatra PDPL taranaka voalohany izahay tamin'ny fampidirana proteinina photosensitizer (PS) amin'ny POI24,25 (sary 1a).Rehefa taratra amin'ny hazavana manga, ny oksizenina singlet dia mamadika ny sisa tavela amin'ny asidra amine nucleophilic proximal, ka miteraka polarity umpolung izay electrophilic ary afaka mihetsika bebe kokoa amin'ny nucleophiles amine probe16,17.Ny probe dia natao miaraka amin'ny tahony alkyne mba hamela ny simika kitiho ary midina ho an'ny LC / MS / MS toetra.
Skema fanoharana momba ny fametahana komplex proteinina navoakan'ny miniSOG.Rehefa tratran'ny hazavana manga, ny sela maneho ny miniSOG-POI dia miteraka oksizenina singlet, izay manova proteinina mifandray fa tsy proteinina tsy mifatotra.Ny vokatra mpanelanelana amin'ny photooxidation dia voasakantsakan'ny etikety fampitaovana ny probe simika amine mba hamoronana adduct covalent.Ny vondrona alkynyl ao amin'ny probe simika dia mamela ny chimie kitihina amin'ny fananan-karena amin'ny alàlan'ny fisintonana midina arahin'ny fatran'ny LC-MS/MS.b Firafitry ny simika amine probe 1-4.c Solontenan'ny fluorescent gel famakafakana ny mitochondrial localized miniSOG-mediated proteomic markers mampiasa probes 1-4 sy ny quantification relatif mifototra amin'ny gel densitometry.Ny tahan'ny signal-to-background amin'ny probes simika dia nodinihina tamin'ny alàlan'ny fanandramana fanaraha-maso ratsy tsy misy hazavana manga na mampiasa sela HEK293T tsy misy fitenenana miniSOG.n = 2 santionany mahaleo tena biolojika.Ny teboka tsirairay dia maneho kopia biolojika.d Fikarohana solontena sy fanisana ny PDPL amin'ny fampiasana probe 3 tsara indrindra raha misy na tsy misy ireo singa PDPL voalaza toy ny c.n = 3 santionany mahaleo tena biolojika.Ny teboka tsirairay dia maneho kopia biolojika.Ny tsipika afovoany sy ny volombava dia maneho ny mean sy ± fivilian-dàlana.CBB: Coomassie Brilliant Blue.e Fametahana oksizenina singlet miaraka amin'ny tasy Si-DMA miloko mena.Haavony: 10 µm.Ny fanaovana sary gel sy ny fanandramana confocal dia naverina tsy miankina in-droa farafahakeliny miaraka amin'ny valiny mitovy.
Nosedrainay aloha ny fahaizan'ny miniSOG26 sy KillerRed23, izay nambara mazava tsara ao amin'ny HEK293T, mba hanelanelana ny fametahana propargylamine ny proteome ho toy ny probe simika (Fanampiana Fig. 1a).Ny famakafakana ny fluorescence gel dia naneho fa ny fametahana proteome manontolo dia tratra tamin'ny alàlan'ny miniSOG sy ny jiro manga manga, raha tsy nisy vokatra marika hita hita tamin'ny KillerRed.Mba hanatsarana ny tahan'ny signal-to-background, dia nanandrana andiana probe simika misy aniline (1 sy 3), propylamine (2), na benzylamine (4) izahay.Hitanay fa ny sela HEK293T dia manana mari-pamantarana ambony kokoa raha oharina amin'ny tsy misy hazavana manga, angamba noho ny photosensitizer riboflavin endogenous, flavin mononucleotide (FMN) 27. Ny probe simika mifototra amin'ny Aniline 1 sy 3 dia nanome mari-pamantarana tsara kokoa, miaraka amin'ny HEK293T izay maneho mazava tsara ny miniSOG ao amin'ny mitochondria mampiseho fitomboana> 8 heny amin'ny famantarana ho an'ny probe 3, raha ny probe 2 ampiasaina amin'ny fomba fametahana RNA CAP-seq ihany no mampiseho ~ 2.5- Ny fitomboan'ny mari-pamantarana mivalona, ​​angamba noho ny safidin'ny fihetsiketsehana samihafa eo amin'ny RNA sy ny proteinina (sary 1b, c). Ny probe simika mifototra amin'ny Aniline 1 sy 3 dia nanome mari-pamantarana tsara kokoa, miaraka amin'ny HEK293T izay maneho mazava tsara ny miniSOG ao amin'ny mitochondria mampiseho fitomboana> 8 heny amin'ny famantarana ho an'ny probe 3, raha ny probe 2 ampiasaina amin'ny fomba fametahana RNA CAP-seq ihany no mampiseho ~ 2.5- Ny fitomboan'ny mari-pamantarana mivalona, ​​angamba noho ny safidin'ny fihetsiketsehana samihafa eo amin'ny RNA sy ny proteinina (sary 1b, c).Ny probe simika mifototra amin'ny Aniline 1 sy 3 dia nampiseho mari-pamantarana tsara kokoa: HEK293T, izay maneho ny miniSOG amin'ny mitochondria, dia mampiseho mihoatra ny 8 heny ny fitomboan'ny famantarana ho an'ny probe 3, raha ny probe 2, ampiasaina amin'ny fomba fametahana CAP-seq RNA, ihany. dia mampiseho ~ 2.5 heny ny fitomboan'ny famantarana, angamba noho ny safidin'ny reactivity samy hafa eo amin'ny RNA sy ny proteinina (sary 1b, c).基于 苯胺 的 化学 探针 1 和 3 具有 更 好 的 特异性, hek293t 在 线 粒体 中 在 表达 线 中 在 表达 minisog, 探针 3 的 信号 增加> 8 倍, 的 增加 于> 8 倍, 而 增加 于> 8 倍, 而 增加 增加> 8 倍, 而 增加 于> 8 倍, 而 增加 增加> 8 倍, 而 增加 于> 8 倍, 而 增加 于 rna 标记 方法 Cap-seq 的的 2 仅 显示2.5-倍信号增加，可能是由于RNA 和蛋白质之间的不同反应偏好（图1b，c）。基于 苯胺 的 化学 探针 1 和 3 具有 更 的 特异性, hek293t 在 粒体 中 在 中 中 稳定 中 中 中. 3 -倍信号增加，可能是由于RNANy probe simika mifototra amin'ny Aniline 1 sy 3 dia manana mari-pamantarana tsara kokoa, HEK293T dia nanambara mazava tsara ny miniSOG ao amin'ny mitochondria, ary ny probe 3 dia nitombo mihoatra ny 8 heny ny mari-pamantarana, raha ny probe 2 ho an'ny fomba fametahana CAP-seq RNA dia tsy nampiseho afa-tsy 2.5-fold.amin'ny famantarana, angamba noho ny safidin'ny fanehoan-kevitra samihafa eo amin'ny RNA sy ny proteinina (sary 1b, c).Ankoatra izany, ny probe 3 isomers sy ny hydrazine probes (probes 5, 6, 7) dia nosedraina, nanamafy ny fanatsarana ny probe 3 (Fig. 1b, c fanampiny).Toy izany koa, ny famakafakana fluorescence in-gel dia naneho ireo mari-pamantarana andrana hafa: ny halavan'ny onjam-pandrefesana (460 nm), ny fifantohana amin'ny probe simika (1 mM), ary ny fotoana irradiation (20 min) (Fig. 2a-c fanampiny).Ny fanesorana ny singa na ny dingana rehetra ao amin'ny protocol PDPL dia nahatonga ny fiverenan'ny mari-pamantarana manan-danja any aoriana (sary 1d).Marihina fa nihena be ny fametahana proteinina noho ny fisian'ny sodium azide na trolox, izay fantatra amin'ny famonoana oksizenina singlet.Ny fisian'ny D2O, izay fantatra amin'ny fanamafisana ny oksizenina singlet, dia manatsara ny famantarana famantarana.Mba hanadihadiana ny fandraisan'anjaran'ireo karazana oksizenina mihetsika hafa amin'ny fametahana, ny mannitol sy ny vitamin C dia nampiana mba hananganana scavengers radical hydroxyl sy superoxide, tsirairay avy, 18, 29, saingy tsy hita fa mampihena ny marika.Ny fanampiana ny H2O2, fa tsy ny fahazavana, dia tsy nahatonga ny fametahana (sary fanampiny 3a).Ny sary oksizenina singlet fluorescence miaraka amin'ny probes Si-DMA dia nanamafy ny fisian'ny oksizenina singlet ao amin'ny tariby HEK293T-miniSOG, fa tsy ao amin'ny tariby HEK293T tany am-boalohany.Ankoatra izany, ny mitoSOX Red dia tsy afaka mamantatra ny famokarana superoxide taorian'ny fahazavana (sary 1e sy fanampiny 3b) 30. Ireo angon-drakitra ireo dia manoro hevitra mafy fa ny oksizenina singlet no karazana oksizenina reactive voalohany tompon'andraikitra amin'ny fametahana proteomika manaraka.Ny cytotoxicity an'ny PDPL dia nodinihina tao anatin'izany ny hazavana manga manga sy ny probe simika, ary tsy nisy cytotoxicity manan-danja hita (Fig. 4a fanampiny).
Mba handinihana ny mekanika fametahana ary ahafahana mamantatra ny proteinina complexes amin'ny alàlan'ny LC-MS/MS, dia mila mamaritra aloha hoe iza amin'ireo asidra amine no ovaina sy ny delta mass amin'ny marika probe.Ny methionine, histidine, tryptophan ary tyrosine dia voalaza fa novain'ny oxygen singlet14,15.Ampifandraisinay amin'ny fikarohana misokatra tsy miangatra nomen'ny sehatra informatika FragPipe miorina amin'ny MSFragger32 ny workflow TOP-ABPP31.Taorian'ny fanovana oksizenina singlet sy ny fametahana fametahana simika, dia natao ny chimie click amin'ny alàlan'ny marika fampihenana biotine misy rohy azo vaky, arahin'ny fanenjanana neutravidin sy ny fandevonan-kanina trypsin.Ny peptide novaina, mbola mifamatotra amin'ny resin, dia nalaina sary ho an'ny fanadihadiana LC-MS / MS (sary 2a sy data fanampiny 1).Betsaka ny fanovana nitranga nandritra ny proteome miaraka amin'ny sarintany peptide 50 (PSM) voatanisa (sary 2b).Mahagaga fa tsy nahita afa-tsy ny fanovana ny histidine izahay, angamba noho ny fihetsehan'ny histidine oxidized amin'ny probe aniline noho ny asidra amino hafa.Araka ny mekanika navoakan'ny oxidation histidine amin'ny oksizenina singlet, 21,33 ny firafitry ny delta-mass amin'ny +229 Da dia mifanitsy amin'ny fampidirana ny probe 3 miaraka amin'ny 2-oxo-histidine aorian'ny oxidation roa, raha ny + 247 Da dia ny vokatra hydrolysis. amin'ny +229 Da (Fig. 5 fanampiny).Ny fanombanana ny spectrum MS2 dia naneho ny fahatokisana avo lenta amin'ny famantarana ny ankamaroan'ny y sy b ion, anisan'izany ny famantarana ny ion fragment modified (y sy b) (sary 2c).Ny famakafakana ny toe-javatra momba ny filaharana eo an-toerana amin'ny histidines novaina PDPL dia nanambara ny safidin'ny motif antonony ho an'ny sisa tavela amin'ny hydrophobic kely amin'ny toerana ± 1 (Fig. 4b fanampiny).Amin'ny ankapobeny, ny histidines 1.4 dia fantatra isaky ny proteinina, ary ny toerana misy ireo marika ireo dia nofaritana tamin'ny alàlan'ny solvent accessible surface area (SASA) sy ny solvent availability (RSA) fanadihadiana (fanampiny sary 4c, d).
Fomba fiasa tsy miangatra amin'ny fandalinana ny fifantenana sisa amin'ny fampiasana ny sehatra informatika FragPipe ampiasain'ny MSFragger.Ny rohy azo vakiana dia ampiasaina amin'ny chimie Click mba ahafahan'ny photocleavage ny peptides novaina avy amin'ny resin'ny streptavidin.Nisy fikarohana misokatra natomboka mba hamantarana ireo fanovana maro, ary koa ny sisa tavela.b Omeo ny habetsaky ny fanovana mitranga manerana ny proteome.Peptide mapping PSM.c MS2 fanondroana spectral ny toerana histidine novaina tamin'ny probe 3. Ho ohatra solontena, ny covalent fanehoan-kevitra miaraka amin'ny probe 3 nanampy +229.0938 Da ny novaina asidra amine.d Famaritana ny mutation ampiasaina amin'ny fitiliana ny marika PDPL.PRDX3 (H155A, H225A) ary PRDX1 (H10A, H81A, H169A) dia nafindra tamin'ny plasmid karazana bibidia ho an'ny fisavana ny saina.e Ny peptide synthetic dia naneho hevitra tamin'ny miniSOG voadio teo anatrehan'ny probe 3 ary ny vokatra mifandraika amin'ny Δm +247 sy +229 dia voamarika tao amin'ny spectrum LC-MS.f Fifandraisana amin'ny proteinina in vitro miaraka amin'ny miniSOG-6xHis-tag sy antibody anti-6xHis.Antibiotin (streptavidin-HRP) sy anti-mouse Western blot analysis ny miniSOG-6xHis/anti-6xHis complexes antibody misy soratra amin'ny probe 3, miankina amin'ny fotoana isehoan'ny hazavana.Ny etikety ho an'ny proteinina tsirairay dia aseho amin'ny lanjan'ny molekiola mifanaraka amin'izany: rojo hazavana antibody LC, rojo mavesatra antibody HC.Ireo andrana ireo dia naverina tsy miankina in-droa fara-fahakeliny miaraka amin'ny vokatra mitovy.
Ho an'ny fanamarinana biochemika amin'ny tranokala fametahana, PRDX3 sy PRDX1 fantatra amin'ny alàlan'ny spectrometry faobe dia novaina avy amin'ny histidine ho alanine ary ampitahaina amin'ny karazana bibidia amin'ny fitiliana transfection.Ny valin'ny PDPL dia naneho fa ny mutation dia nampihena be ny marika (sary 2d).Mandritra izany fotoana izany, ny filaharan'ny peptide fantatra amin'ny fikarohana misokatra dia novolavolaina ary nihetsika in vitro miaraka amin'ny miniSOG voadio teo anatrehan'ny probe 3 sy hazavana manga, izay manome vokatra miaraka amin'ny fiovan'ny +247 sy +229 Da rehefa hitan'ny LC-MS (Fig). . 2e).).Mba hitsapana raha mety ho voasoritra ao anaty vitro ny proteinina proximal mifandray amin'ny valin'ny photoactivation miniSOG, dia nanamboatra fitiliana akaiky artifisialy izahay tamin'ny alàlan'ny fifandraisana misy eo amin'ny proteinina miniSOG-6xHis sy ny antibody monoclonal anti-ny in vitro (sary 2f).Amin'ity assay ity dia nanantena ny fametahana proximal ny rojo mavesatra sy maivana antibody miaraka amin'ny miniSOG.Raha ny marina, ny anti-mouse (fantatra ny rojo mavesatra sy maivana an'ny antibody anti-6xHis-labeled) sy ny streptavidin Western blots dia nampiseho biotinylation mahery ny rojo mavesatra sy maivana.Marihina fa nahatsikaritra ny autobiotinylation miniSOG izahay noho ny tenifototra 6xHis sy ny fifandraisana misy eo amin'ny rojo maivana sy mavesatra, izay mety misy ifandraisany amin'ny elanelana voalaza teo aloha teo anelanelan'ny lysine sy ny valin'ny proximal 2-oxo-histidine.Ho fehin-kevitra dia manatsoaka hevitra izahay fa ny PDPL dia manova ny histidine amin'ny fomba miankina akaiky.
Ny tanjonay manaraka dia ny mamaritra ny proteome subcellular mba hitsapana ny maha-tokana ny fametahana in situ.Noho izany dia naneho ny miniSOG izahay tao amin'ny nucleus, mitochondrial matrix, na ny membrane ER ivelany amin'ny sela HEK293T (sary 3a).Ny famakafakana ny fluorescence amin'ny gel dia nampiseho fatorana misy marika be dia be amin'ny toerana telo subcellular ary koa ny fomba fametahana marika (sary 3b).Ny fanadihadiana momba ny fluorescence dia naneho ny mari-pahaizana ambony amin'ny PDPL (sary 3c).Ny workflow PDPL dia narahin'ny fanehoan-kevitra kitiho miaraka amin'ny loko rhodamine mba hamaritana ny proteomes subcellular amin'ny fampiasana microscopy fluorescence, ary ny mari-pamantarana PDPL dia nalaina tamin'ny DAPI, mitochondrial trackers, na ER trackers, manamafy ny fahatokiana ambony amin'ny PDPL.Ho an'ireo toerana telo organelle, ny fampitahana mifanila amin'ny PDPL miaraka amin'ny TurboID amin'ny fampiasana avidin western blot dia mampiseho fa ny PDPL dia nasiana marika manokana raha oharina amin'ny fanaraha-maso azy ireo.Eo ambanin'ny fepetra PDPL dia misy tarika misy marika maromaro kokoa, izay manondro proteinina misy marika PDPL maro kokoa (sary fanampiny 6a-d).
fanehoana schematic amin'ny fametahana proteome manokana organelle-mediated miniSOG.miniSOG dia mikendry ny mitochondrial matrix amin'ny alàlan'ny fusion mankany amin'ny asidra amine N-terminal 23 an'ny COX4 (mito-miniSOG), ny nucleus amin'ny alàlan'ny fusion amin'ny H2B (nucleus-miniSOG), ary ny Sec61β amin'ny lafiny cytoplasmic amin'ny membrane ER (ER-miniSOG). ).Ny famantarana dia ahitana ny gel imaging, confocal imaging, ary ny mass spectrometry.b Sarin'ny gel solontenan'ny profil PDPL telo manokana organelle.CBB Coomassie Brilliant Blue.c Sarin'ny solontenan'ny sela HEK293T izay maneho ny miniSOG miaraka amin'ny localizations subcellular isan-karazany hitan'ny antibody misy marika V5 (mena).Ny marika subcellular dia ampiasaina amin'ny mitochondria sy ER (maitso).Ny workflow PDPL dia ahitana ny fitadiavana ny proteome subcellular misy marika miniSOG (mavo) mampiasa cy3-azide click simia.Haavony: 10 µm.d Tetika volkano misy proteomes misy marika PDPL ao amin'ny organelles isan-karazany nohamarinina amin'ny fatra tsy misy marika (n = 3 fanandramana biolojika tsy miankina).Ny t-test an'ny Mpianatra roa rambo dia nampiasaina tamin'ny faritra volkano.HEK293T karazana wild dia nampiasaina ho fanaraha-maso ratsy. Ny proteinina niova be dia asongadina amin'ny mena (p <0.05 sy > 2-fold ny fahasamihafan'ny hamafin'ny ion). Ny proteinina niova be dia asongadina amin'ny mena (p <0.05 sy > 2-fold ny fahasamihafan'ny hamafin'ny ion). Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и >2-кратная разница в интенсивности ионов). Ny proteinina niova be dia asongadina amin'ny mena (p <0.05 sy> 2 heny ny fahasamihafana amin'ny hamafin'ny ion).显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0.05 和> 2 倍离子强度差异）.显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0.05和> 2 Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и > 2-кратная разница в ионной силе). Ny proteinina niova be dia asongadina amin'ny mena (p <0.05 sy> fahasamihafan'ny 2 heny amin'ny tanjaky ny ionic).Ireo proteinina mifandraika manan-danja amin'ny HEK293T-miniSOG fa tsy manan-danja amin'ny HEK293T dia aseho amin'ny maitso.e Famakafakana ny maha manokana ny angona proteomika avy amin'ny andrana d.Ny fitambaran'ny proteinina manan-danja amin'ny statistika ao amin'ny organelle tsirairay (teboka mena sy maitso) dia voamarika eo an-tampony.Ny histograma dia mampiseho proteinina ao amin'ny organelles mifototra amin'ny MitoCarta 3.0, fanadihadiana GO ary A. Ting et al.olona.Angon-drakitra misaraka ho an'ny mitochondria, nuclei ary ER.Ireo andrana ireo dia naverina tsy miankina in-droa fara-fahakeliny miaraka amin'ny vokatra mitovy.Ny angona manta dia omena amin'ny endrika rakitra data manta.
Namporisika ny valin'ny gel sy ny sary, ny fandrefesana tsy misy marika dia nampiasaina mba hamaritana ny proteome fantatra amin'ny organelle tsirairay (Data fanampiny 2).HEK293T tsy voafindra dia nampiasaina ho fanaraha-maso ratsy hanesorana ireo marika ambadika. Ny fanadihadiana momba ny volkano dia nampiseho proteinina manankarena be (p <0.05 sy> 2-fold ny hamafin'ny ion) ary koa ny proteinina tokana izay tsy misy afa-tsy amin'ny tsipika maneho miniSOG (sary 3d teboka mena sy maitso). Ny fanadihadiana momba ny volkano dia nampiseho proteinina manankarena be (p <0.05 sy> 2-fold ny hamafin'ny ion) ary koa ny proteinina tokana izay tsy misy afa-tsy amin'ny tsipika maneho miniSOG (sary 3d teboka mena sy maitso). Анализ графика вулкана показал значительно обогащенные белки (p <0, 05 и > 2-кратная интенсивность ионов), а также одиночные белки, которые присутствуют только в линиях, экспрессирующих miniSOG (рис. 3d, красные и зеленые точки). Ny fanadihadiana momba ny volkano dia nampiseho proteinina manankarena be (p<0.05 sy> 2-fold ions intensity) ary koa proteinina tokana izay tsy misy afa-tsy amin'ny tsipika miniSOG (sary 3d, teboka mena sy maitso).火山图 分析 显示 出 显着 富集 的 蛋白质 (p <0.05 和> 2 倍 离子离子) 以及 仅 存 在于 MinSog 表达 系 中 的 表达 系 中 的 单一 蛋白质 (中.火山图 分析 显示 出 显着 的 蛋白质 （p <0.05 和> 2 倍 离子 强度） 仅 存 在于 在于 minisog 表达 系 的 单一 蛋白质 （图 3d 红色 绿色点。。。）））））））））） Анализ графика вулкана выявил значительно обогащенные белки (p <0, 05 и> 2x ионная сила), а также отдельные белки, присутствующие только в экспрессионной линии miniSOG (красные и зеленые точки на рис. 3d). Ny fanadihadiana momba ny volkano dia nanambara proteinina manankarena be (p<0.05 sy> 2x hery ionika) ary koa proteinina tokana tsy misy afa-tsy amin'ny tsipika fanehoana miniSOG (teboka mena sy maitso amin'ny sary 3d).Ny fampifangaroana ireo angon-drakitra ireo dia fantatray fa 1364, 461, ary 911 nokleary, mitochondrial ary ER ivelany proteinina ivelany.Mba handinihana ny fahamarinan'ny PDPL organelle-localized, dia nampiasa ny MitoCarta 3.0, Gene Ontology (GO), ary A. Ting et al.Ny data set8 dia nampiasaina ho an'ny mitochondria, nucleus, ary ER mba hitsapana ny maha-tokana ny organelle ny proteinina hita, mifanaraka amin'ny fahamarinan'ny 73.4, 78.5, ary 73.0% (sary 3e).Ny fahasamihafan'ny PDPL dia manamafy fa ny PDPL dia fitaovana tsara indrindra hamantarana ny proteome manokana organelle.Ny famakafakana ny subochondrial momba ny proteinina mitochondrial fantatra dia nampiseho fa ny proteinina voafandrika dia nozaraina indrindra tao amin'ny matrices sy ny membrane anatiny (226 sy 106, tsirairay avy), izay mitentina 91.7% (362) amin'ny totalin'ny proteinina mitochondrial fantatra.Ny haavon'ny PDPL avo dia nohamafisina ihany koa (Fig. 7a fanampiny).Toy izany koa, ny famakafakana subnuclear dia nampiseho fa ny proteinina voasambotra dia nozaraina indrindra tao amin'ny nucleus, nucleoplasm, ary nucleolus (Fig. 7b fanampiny).Ny famakafakana proteomika nokleary miaraka amin'ny peptide signal localization nokleary (3xNLS) dia nampiseho fahitsiana mitovy amin'ny fananganana H2B (sary fanampiny 7c-h).Mba hamaritana ny maha-tokana ny marika PDPL, ny laminin nokleary A dia nofinidy ho fandrika POI7 voatokana kokoa.Ny PDPL dia namaritra proteinina 36 tena manankarena, izay ny proteinina 12 (30.0% ao anatin'izany ny lamin A) dia voamarika tsara amin'ny proteinina mifandray amin'ny lamin A voamariky ny angon-drakitra String, miaraka amin'ny isan-jato ambony kokoa noho ny fomba BioID (proteinina 122) 28 amin'ny 28. , 22.9 %) 7. Ny fombantsika dia nahitana proteinina vitsy kokoa, angamba noho ny faritra misy marika voafetra, izay natao tamin'ny oksizenina singlet mavitrika kokoa.Ny famakafakana GO dia nampiseho fa ny proteinina fantatra dia hita indrindra ao amin'ny nucleoplasm (26), membrane nokleary (10), membrane nokleary (9), ary pores nokleary (5).Amin'ny fitambarany, ireo proteinina nokleary eo an-toerana ireo dia mitentina 80% amin'ny proteinina manankarena, izay mampiseho bebe kokoa ny maha-tokana ny PDPL (Fig. 8a-d fanampiny).
Rehefa avy nametraka ny fahafahan'ny PDPL hanao marika akaiky amin'ny organelles, dia nozahanay raha azo ampiasaina handinihana ireo mpiara-miombon'antoka POI ny PDPL.Indrindra indrindra, nitady ny hamaritana ny famakafakana PDPL momba ny proteinina cytosolic izahay, izay heverina ho tanjona sarotra kokoa noho ny mpiara-miasa aminy amin'ny membrane noho ny toetrany mavitrika.Ny proteinina bromodomain sy extraterminal (BET) BRD4 dia nanintona ny saintsika noho ny anjara asany lehibe amin'ny aretina isan-karazany 35, 36.Ny complexe noforonin'ny BRD4 dia coactivator transcriptional ary tanjona ara-pahasalamana lehibe.Amin'ny alàlan'ny fanaraha-maso ny fitenin'ny c-myc sy Wnt5a, ny BRD4 dia heverina ho tena fototry ny leukemia myeloid acute (AML), myeloma marobe, lymphoma Burkitt, kanseran'ny colon ary areti-mifindra37,38.Ho fanampin'izay, ny viriosy sasany dia mikendry ny BRD4 mba hifehy ny transcription virus sy sela, toy ny papillomavirus, VIH, ary SARS-CoV-236,39.
Mba hanaovana sarintany ny fifandraisana BRD4 amin'ny fampiasana PDPL, dia natambatray ny miniSOG miaraka amin'ny isoform N- na C-terminal fohy an'ny BRD4.Ny valin'ny proteomika dia naneho ny fifandonana avo lenta teo amin'ireo fananganana roa (fanampiny sary 9a).Ny proteinina nokleary fantatra amin'ny miniSOG-H2B dia mandrakotra ny 77.6% amin'ny proteinina mifandray amin'ny BRD4 (sary fanampiny 9b).Avy eo, ny fotoana samihafa amin'ny fahazavana (2, 5, 10, 20 min) dia nampiasaina hanitsiana ny radius marika (sary 4a sy data fanampiny 3).Manatsoaka hevitra izahay fa amin'ny photoperiods fohy kokoa, ny PDPL dia hanao marika voalohany amin'ny mpiara-miombon'antoka mivantana, raha ny vanim-potoana lava kokoa dia ahitana proteinina fantatra mandritra ny vanim-potoanan'ny photoactivation fohy ary koa ny tanjona ankolaka amin'ny fametahana marika.Raha ny marina dia nahita fifandonana mahery vaika teo amin'ny teboka mifanakaiky izahay (84.6% ho an'ny 2 sy 5 min; 87.7% ho an'ny 5 sy 10 min; 98.7% ho an'ny 10 sy 20 min) (sary 4b sy fanampiny 9c).Ao amin'ny vondrona andrana rehetra, tsy ny BRD4 irery ihany no hitanay fa lasibatra fantatra toy ny MED1, CHD8, BICRA, NIPBL, SMC1A, ary HMGB1 voarakitra ao amin'ny angon-drakitra.Ny tanjaky ny ionic amin'ireo tanjona ireo dia mifandanja amin'ny fotoana fiparitahana (sary 4c sy sary fanampiny 9d).Ny famakafakana GO ny proteinina hita ao amin'ny vondrona 2-minitra dia nampiseho fa ny proteinina fantatra dia napetraka tao amin'ny nucleus ary nandray anjara tamin'ny fanavaozana chromatin sy ny RNA polymerase function.Ny fiasan'ny molekiola amin'ny proteinina dia nanan-karena tamin'ny chromatin binding na transcriptional coactivation, mifanaraka amin'ny fiasan'ny BRD4 (sary 4d).Ny famakafakana ny fifandraisana amin'ny proteinina mifototra amin'ny angon-drakitra dia nanambara ny ambaratonga voalohany amin'ny fifandraisana ankolaka eo amin'ny BRD4 sy ny fianakaviana HDAC mifandray amin'ny complexes toy ny SIN3A, NCOR2, BCOR, ary SAP130 (sary 4e sy Supplementary Fig. 9e), mifanaraka amin'ny BRD4 sy HDAC binding acetylated histones ..Fanampin'izany, ny tanjona solontenan'ny LC-MS/MS, anisan'izany ny Sin3A, NSUN2, Fus, ary SFPQ, dia nohamafisin'ny Western blotting (sary 4f).Vao haingana, ny isoforme fohy an'ny BRD4 dia voalaza fa mamorona nuclei miaraka amin'ny fanasarahana ny fasa-drano (LLPS).Ny proteinina mifamatotra amin'ny RNA Fus sy SFPQ dia manelanelana ny LLPS amin'ny fizotry ny sela isan-karazany ary fantatra eto ho proteinina mifatotra BRD4 tsy voarakitra.Ny fifandraisana misy eo amin'ny BRD4 sy ny SFPQ dia nohamafisin'ny fanandramana co-immunoprecipitation (co-IP) (sary 4g), manolotra fomba fiasa hafa ho an'ny fisarahana amin'ny alàlan'ny ranon-tsolika BRD4 izay mendrika ny fanadihadiana bebe kokoa.Raha atambatra, ireo valiny ireo dia manoro hevitra fa ny PDPL dia sehatra tsara indrindra hamantarana ny fifandraisana BRD4 fantatra ary koa ny proteinina mifamatotra tsy fantatra.
fanehoana schematic amin'ny mari-pamantarana akaiky ny miniSOG-mediated BRD4, fotoana fandefasana: 2, 5, 10, ary 20 min.b Fifanin'ny proteinina hita amin'ny fotoana fahazavana samihafa.Ny fampitomboana proteinina hita ao amin'ny HEK293T-miniSOG-BRD4 dia manan-danja ara-statistika raha oharina amin'ny HEK293T karazana bibidia.c Ny hamafin'ny Ion rehefa manombana ny solontena tsy misy marika fantatra amin'ny proteinina BRD4 mamatotra mandritra ny fotoana voafaritra.n = 3 santionany mahaleo tena biolojika.Ny angon-drakitra dia aseho ho mean ± deviation mahazatra.d Gene ontological analysis (GO) ny proteinina hita ao amin'ny vondrona 2 minitra.Voatanisa ny teny folo GO voalohany.Miloko araka ny sokajy GO teny ny bubbles, ary ny haben'ny bubble dia mifandanja amin'ny isan'ny proteinina hita isaky ny fe-potoana.e Famakafakana tadin'ny proteinina mifandray amin'ny BRD4.Ny boribory mavo dia lakaoly mivantana ary ny boribory volondavenona no sosona voalohany amin'ny lakaoly ankolaka.Ny tsipika mena dia maneho ny fifaneraserana voafaritry ny andrana ary ny tsipika manga dia maneho ny fifandraisana efa voavinavina.f Ny tanjona mamatotra BRD4 solontenan'ny LC-MS/MS dia nohamarinin'ny Western blotting.g Ny fanandramana co-immunoprecipitation dia manamafy ny fifandraisana misy eo amin'ny SFPQ sy BRD4.Ireo andrana ireo dia naverina tsy miankina in-droa fara-fahakeliny miaraka amin'ny vokatra mitovy.Ny angona manta dia omena amin'ny endrika rakitra data manta.
Ho fanampin'ny famantarana ireo lasibatra mifandraika amin'ny POI tsy voasoratra, dia mihevitra izahay fa ny PDPL dia mety amin'ny famantarana ny substrate ho an'ny enzymes, izay mitaky ny fanoritsoritana ny proteinina mifamatotra ankolaka amin'ny complexes lehibe mba hanoratana substrates tsy voasoratra.Parkin (voarakitra amin'ny PARK2) dia ligase E3 ary ny fiovan'ny parkin dia fantatra fa miteraka aretina Parkinson (AR-JP) autosomal recessive tanora (AR-JP)42.Ankoatr'izay, ny parkin dia nofaritana ho tena ilaina amin'ny mitophagy (mitochondrial autophagy) sy ny fanesorana ireo karazana oksizenina mihetsika.Na izany aza, na dia efa fantatra aza ny substrate parkin maromaro, ny anjara asan'ny parkin amin'ity aretina ity dia mbola tsy mazava.Mba hanamarihana ny substrate tsy misy dikany, ny PDPL dia nosedraina tamin'ny fampidirana miniSOG amin'ny N- na C-terminus parkin.Ny sela dia notsaboina tamin'ny transporter proton carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone (CCCP) mba hampavitrika ny parkin amin'ny alàlan'ny lalana PINK1-Parkin.Raha ampitahaina amin'ny valin'ny BRD4 PDPL, ny parkin N-terminus fusion dia nanambara karazana proteinina kendrena lehibe kokoa, na dia nandrakotra ampahany betsaka amin'ny C-terminus (177 amin'ny 210) (sary 5a, b ary data fanampiny 4).ny vokatra dia mifanaraka amin'ny tatitra fa ny marika N-terminal dia afaka manetsika ny Parkin44.Mahagaga fa tsy nisy afa-tsy proteinina 18 nifanizina tamin'ny angon-drakitray miaraka amin'ny valin'ny AP-MS navoaka ho an'ny Parkin43, azo inoana fa noho ny tsy fitovian'ny tsipika sela sy ny workflows proteomika.Ankoatra ny proteinina efatra fantatra (ARDM1, HSPA8, PSMD14, ary PSMC3) fantatra amin'ny fomba roa (sary 5c)43.Mba hanamafisana bebe kokoa ny valin'ny LC-MS / MS, ny fitsaboana PDPL sy ny famafazana tandrefana manaraka dia nampiasaina mba hampitahana ny valin'ny fitsapana sela HEK293T sy ny tsipika parkin N-terminal.Ny tanjona tsy fantatra taloha CDK2, DUT, CTBP1, ary PSMC4 dia nosedraina tamin'ny binder fantatra, DNAJB1 (sary 5d).
Volkano planin'ny proteinina mifandray amin'ny parkin ao amin'ny sela HEK293T miaraka amin'ny miniSOG mipoitra amin'ny alàlan'ny N- na C-terminus parkin (n = 3 andrana biolojika tsy miankina).Ny t-test an'ny Mpianatra roa rambo dia nampiasaina tamin'ny faritra volkano.HEK293T dia nampiasaina ho fanaraha-maso ratsy. Ny proteinina niova be dia asongadina amin'ny mena (p <0.05 sy > 2-fold ny fahasamihafan'ny hamafin'ny ion). Ny proteinina niova be dia asongadina amin'ny mena (p <0.05 sy > 2-fold ny fahasamihafan'ny hamafin'ny ion). Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и >2-кратная разница в интенсивности ионов). Ny proteinina niova be dia asongadina amin'ny mena (p <0.05 sy> 2 heny ny fahasamihafana amin'ny hamafin'ny ion).显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0.05 和> 2 倍离子强度差异）.显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0.05和> 2 Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и > 2-кратная разница в ионной силе). Ny proteinina niova be dia asongadina amin'ny mena (p <0.05 sy> fahasamihafan'ny 2 heny amin'ny tanjaky ny ionic).Ireo proteinina mifandraika manan-danja amin'ny HEK293T-miniSOG fa tsy manan-danja amin'ny HEK293T dia aseho amin'ny maitso.b diagram Venn mampiseho proteinina mifanindry eo amin'ny fananganana terminal N sy C.Ny marika N-terminal dia afaka manetsika ny parkin ary miteraka proteinina fantatra kokoa.c Diagram Venn mampiseho proteinina mifanindry eo amin'ny PDPL sy AP-MS.Voatanisa ny mpanelanelana fantatra, ahitana proteinina 4 amin'ny 18 mifanindry ary proteinina 11 amin'ny 159 voafaritra manokana ao amin'ny PDPL.d Nohamarinin'ny famafazana tandrefana ireo lasibatra solontenan'ny LC-MS/MS.e Ssu72 sy SNW1 dia fantatra fa substrate parkin tsy voasoratra anarana.Ireo plasmid proteinina misy marika FLAG ireo dia nafindra tao amin'ny HEK293T sy HEK293T-Parkin-miniSOG arahin'ny fitsaboana CCCP amin'ny fotoana samihafa.Ny fahapotehana dia niharihary kokoa tao amin'ny tsipika fanehoana tafahoatra Parkin.f Amin'ny fampiasana ny inhibitor proteasome MG132, dia voamarina fa ny fizotran'ny fanimbana ny Ssu72 sy SNW1 dia mpanelanelana amin'ny proteasome-ubiquitination.Ireo andrana ireo dia naverina tsy miankina in-droa fara-fahakeliny miaraka amin'ny vokatra mitovy.Ny angona manta dia omena amin'ny endrika rakitra data manta.
Marihina fa ny proteinina voamariky ny PDPL dia tsy maintsy ahitana proteinina mifamatotra amin'ny parkin sy ny substrate.Mba hamantarana ny substrate parkin tsy voasoratra dia nisafidy proteinina fito fantatra izahay (PUF60, PSPC1, UCHL3, PPP1R8, CACYBP, Ssu72 ary SNW1) ary ny plasmids nafindra mba hampiharihary ireo fototarazo ireo amin'ny HEK293T mahazatra ary maneho ny fitsaboana HEK293T miniSOG-Parkin arahin'ny CCCP.Ny haavon'ny proteinina Ssu72 sy SNW1 dia nihena be tao amin'ny tsipika miniSOG-Parkin stable (sary 5e).Ny fitsaboana miaraka amin'ny CCCP nandritra ny 12 ora dia niteraka fahasimbana lehibe indrindra tamin'ny substrate roa.Mba hanadihadiana raha fehezin'ny proteasome-ubiquitination ny fanimbana ny Ssu72 sy SNW1, dia nampiana ny inhibitor proteasome MG132 mba hanakanana ny hetsika proteasome, ary raha ny marina dia hitanay fa voasakana ny fizotry ny fanimbana azy ireo (sary 5f).Ny lasibatra tsy misy substrate fanampiny dia nohamafisina ho mpanelanelana Parkin amin'ny fampiasana famafazana tandrefana (Fig. 10 fanampiny), izay nampiseho vokatra mifanaraka amin'ny LC-MS / MS.Ho fehin-kevitra, ny fampidirana ny workflow PDPL miaraka amin'ny fanamarinana transfection proteinina kendrena dia mamela ny famantarana ny substrates ligase E3 tsy voasoratra anarana.
Namolavola sehatra fanamarihan'ny akaiky mahazatra izahay izay ahafahanao mamantatra ireo POI mifandray amin'ny habaka sy ny fotoana.Ny sehatra dia mifototra amin'ny proteinina miniSOG photosensitizer, izay eo amin'ny 12 kDa fotsiny, latsaky ny antsasaky ny haben'ny anzima APEX2 matotra (27 kDa) ary ny ampahatelony ny haben'ny TurboID (35 kDa).Ny habe kely kokoa dia tokony hanitatra be ny isan'ny fampiharana amin'ny fandalinana fifandraisana proteinina kely.Ny fikarohana fanampiny momba ny photosensitizers fanampiny, na proteinina voafantina na molekiola kely, dia ilaina mba hampitomboana ny fatran'ny oksizenina singlet sy hanitarana ny fahatsapan'ity fomba ity.Ho an'ny miniSOG amin'izao fotoana izao, ny famahana ara-potoana avo lenta dia azo tratrarina amin'ny alàlan'ny jiro manga mba hampavitrika ireo marika akaiky.Ho fanampin'izany, ny fotoana fampandrenesana lava kokoa dia namoaka "rahona" amin'ny oksizenina singlet lehibe kokoa, ka nahatonga ny fanovana ny sisa tavela histidine lavitra kokoa, ny haavon'ny fametahana marika, ary ny fahafahana manatsara ny famahana ny PDPL spatial.Nanandrana fitsapana simika fito ihany koa izahay mba hampitomboana ny tahan'ny signal-to-background ary nandinika ny mekanika molekiola ao ambadik'ity fomba ity.Ny workflow TOP-ABPP miaraka amin'ny fikarohana misokatra tsy miangatra dia nanamafy fa ny fanovana dia tsy nisy afa-tsy tamin'ny histidines ary tsy nisy microenvironment mifanaraka amin'ny fitomboan'ny fanovana histidine, afa-tsy ny safidy antonony ho an'ny histidines ao amin'ny faritra loop.
Ny PDPL dia nampiasaina ihany koa mba hamaritana ireo proteome subcellular miaraka amin'ny proteome manokana sy ny fandrakofana farafaharatsiny azo ampitahaina amin'ny fametahana marika akaiky sy ny fomba fikarohana simika manokana momba ny organelle.Ny mari-pamantarana akaiky koa dia nampiasaina tamim-pahombiazana mba hamaritana ny ety ivelany, ny lysosomal, ary ny proteomes mifandray amin'ny secretome46,47.Mino izahay fa ny PDPL dia hifanaraka amin'ireo organelles subcellular ireo.Fanampin'izany, nanohitra ny PDPL izahay tamin'ny alàlan'ny famantarana ny tanjona ho an'ny fatorana proteinina cytosolika izay sarotra kokoa noho ny proteinina mifatotra amin'ny membrane noho ny toetrany mavitrika sy ny fandraisana anjara amin'ny fifandraisana ara-nofo kokoa.Ny PDPL dia nampiharina tamin'ny proteinina roa, ny coactivator transcriptional BRD4 ary ny ligase E3 Parkin mifandray amin'ny aretina.Ireo proteinina roa ireo dia nofidina tsy noho ny asany fototra biolojika, fa koa noho ny maha-zava-dehibe azy ireo amin'ny klinika sy ny mety ho fitsaboana.Ho an'ireo POI roa ireo dia fantatra ireo mpiara-miombon'antoka fanta-daza ary koa ireo lasibatra tsy voasoratra.Marihina fa ny proteinina mifandraika amin'ny fisarahana amin'ny dingana SFPQ dia nohamafisin'ny co-IP, izay mety hanondro mekanika vaovao izay ahafahan'ny BRD4 (isoform fohy) mifehy ny LLPS.Amin'izany fotoana izany, mino izahay fa ny famantarana ny substrate Parkin dia toe-javatra iray izay ilana ny famantarana ny adhesive ankolaka.Nahita substrate parkin roa tsy fantatra izahay ary nanamafy ny fahapotehan'izy ireo tamin'ny lalan'ny ubiquitination-proteasome.Vao haingana, nisy tetikady fandrika mifototra amin'ny mekanika novolavolaina hamantarana ireo substrate hydrolase amin'ny alàlan'ny famandrihana azy ireo amin'ny enzymes.Na dia fomba mahery vaika aza izany, dia tsy mety amin'ny famakafakana ny substrate tafiditra amin'ny fananganana komples lehibe ary mitaky ny fananganana fifamatorana covalent eo amin'ny enzyme sy ny substrate.Manantena izahay fa ny PDPL dia azo itarina amin'ny fandalinana ny proteinina sy ny fianakaviana enzyme hafa, toy ny fianakaviana deubiquitinase sy metalloprotease.
Ny endrika vaovao amin'ny miniSOG, antsoina hoe SOPP3, dia novolavolaina miaraka amin'ny famokarana oksizenina singlet nohatsaraina.Nampitahainay ny miniSOG tamin'ny SOPP3 ary nahita fanatsarana ny mari-pamantarana, na dia mbola tsy niova aza ny tahan'ny signal-to-noise (Fig. 11 fanampiny).Noheverinay fa ny fanatsarana ny SOPP3 (ohatra, amin'ny alàlan'ny evolisiona mivantana) dia hitarika ho amin'ny proteinina photosensitizer mahomby kokoa izay mitaky fotoana fohy kokoa ary mamela ny fizotran'ny sela mavitrika kokoa.Marihina fa ny PDPL amin'izao fotoana izao dia voafetra amin'ny tontolo finday satria mitaky hazavana manga manga ary tsy afaka miditra amin'ny tavy lalina.Ity endri-javatra ity dia manakana ny fampiasana azy amin'ny fianarana modely biby.Na izany aza, ny fampifangaroana ny optogenetika miaraka amin'ny PDPL dia mety hanome fahafahana ho an'ny fikarohana biby, indrindra ao amin'ny atidoha.Ho fanampin'izany, ny photosensitizers infrarouge hafa namboarina ihany koa dia manala izany fetra izany.Efa mandeha ny fikarohana amin’io lafiny io amin’izao fotoana izao.
Ny tsipika sela HEK293T dia azo avy amin'ny ATCC (CRL-3216).Ny tsipika sela dia nanandrana ratsy ho an'ny otrikaretina mycoplasma ary novolavolaina tao amin'ny DMEM (Thermo, #C11995500BT) nampian'ny 10% foetal bovine serum (FBS, Vistech, #SE100-B) ary 1% penicillin / streptomycin (Hyclone, #SV30010).lehibe ao.
3-Aminophenylene (sample 3) sy (4-ethynylphenyl) metanamine (sample 4) dia novidina tamin'ny Bidepharm.Ny propylamine (probe 2) dia novidina tamin'ny Energy-chemicals.N-(2-Aminophenyl)pent-4-ynamide (probe 1) dia namboarina araka ny fomba navoaka.
Ny tabilao fanampiny 1 dia mitanisa ny fananganana fototarazo ampiasaina amin'ity fandalinana ity.Ny sequences miniSOG sy KillerRed dia nalaina avy amin'ny plasmid fanomezana avy amin'ny P. Zou (University Peking).Ny filaharana mikendry ny mitochondrial dia avy amin'ny asidra amine 23 N-terminal an'ny COX4 ary nalaina tao amin'ireo vectors voalaza tamin'ny alàlan'ny fivoriambe Gibson (Beyotime, #D7010S).Mba mikendry ny membrane sy ny nucleus amin'ny reticulum endoplasmic, ny ADN SEC61B (NM_006808.3) (NEB, #M0491L) nohamafisin'ny PCR avy amin'ny tranomboky cDNA an'ny sela HEK293T, ary ny ADN H2B (natolotry ny D. Lin, Shenzhen Bay Laboratory) ary cloned , araka ny voalaza etsy ambony.Raha tsy misy fanamarihana manokana, ny fototarazo proteinina hafa ampiasaina amin'ny fifindrana sy ny fananganana tsipika sela marin-toerana dia nohamafisin'ny PCR avy amin'ny tranomboky cDNA sela HEK293T.G3S (GGGS) sy G4S (GGGGS) dia nampiasaina ho mpampitohy ny proteinina sy ny miniSOG.Nisy tenifototra V5 epitope (GKPIPNPLLGLDST) nampiana tamin'ireo fanamboarana fusion ireo.Ho fanehoana amin'ny biby mampinono sy hametrahana tsipika sela marin-toerana, ny fananganana fusion miniSOG dia nalaina tao amin'ny vector lentiviral pLX304.Ho an'ny fanehoana bakteria, miniSOG dia nalaina tao amin'ny vector pET21a misy marika 6xHis ao amin'ny C-terminus.
Ny sela HEK293T dia nafafy tamin'ny sela 2.0 x 105 isaky ny lavadrano tao anaty takelaka enina ary nafindra 24 ora taty aoriana miaraka amin'ny plasmids lentiviral recombinant (2.4 μg pLX304) ary plasmids fonosana viriosy (1.5 μg psPAX2 sy 1.2 μg pMD2. , #C0533), manodidina ny 80% fusion.Aorian'ny famindrana mandritra ny alina dia novaina ny fitaovana ary natsofoka nandritra ny 24 ora hafa.Ny fanangonana ny viriosy dia natao taorian'ny 24, 48 ary 72 ora.Talohan'ny otrikaretina ny tsipika sela kendrena, ny viriosy dia voasivana tamin'ny alàlan'ny sivana 0.8 μm (Merck, #millex-GP) ary ny polybrene (Solarbio, #H8761) dia nampidirina tamin'ny fifantohana 8 μg / ml.Rehefa afaka 24 ora, dia navela hiverina indray ny sela amin'ny fanovana ny fitaovana.Ny sela dia nofantenana tamin'ny fampiasana 5 μg / ml blasticidin (Solarbio, #3513-03-9) ho an'ny andalana telo voalohany ho safidy henjana ambany kokoa.Avy eo dia nampiasa 20 μg / ml ho fomba henjana kokoa ho an'ny andalana telo manaraka.
Ny sela dia nafafy tao amin'ny efitrano fantsakana 12 (Ibidi, #81201) amin'ny hakitroky ny sela 20.000 eo ho eo isaky ny lavadrano.Mba hanatsarana ny fidiran'ny sela HEK293T, ampio 50 µg/ml fibronectin (Corning, #356008) voatoto ao anaty saline phosphate buffered (PBS, Sangon, #B640435) amin'ny 37°C.Nokarakaraina nandritra ny adiny 1 ny efitrano ary nesorina tamin'ny PBS.Taorian'ny 24 ora, ny sela dia nosasana indray mandeha tamin'ny PBS, nopotehina tamin'ny 1 mM probe 3 amin'ny vahaolana sira voalanjalanja Hanks vaovao (HBSS, Gibco, #14025092) mandritra ny 1 ora amin'ny 37 ° C, ary avy eo dia natsipy tamin'ny LED manga (460 nm). ).) dia nodiovina nandritra ny 10 minitra tamin'ny mari-pana.Aorian'izany, dia nosasana indroa tamin'ny PBS ny sela ary napetraka tamin'ny formaldehyde 4% ao amin'ny PBS (Sangon, #E672002) mandritra ny 15 minitra amin'ny mari-pana amin'ny efitrano.Ny formaldehyde be loatra dia nesorina tamin'ny sela raikitra tamin'ny fanasana in-telo tamin'ny PBS.Ny sela avy eo dia nafindra tamin'ny 0.5% Triton X-100 (Sangon, # A600198) tao amin'ny PBS ary nosasana in-3 tamin'ny PBS.Esory avy eo ny efitrano ary ampio isaky ny santionany 25 µl fangaro fanehoan-kevitra kitiho misy 50 µM Cy3-azide (Aladdin, #C196720), 2 mM CuSO4 (Sangon, #A603008), 1 mM BTTAA (Confluore, #BDJ-4) ary 0,5 mg / ml sodium ascorbate (Aladdin, no. S105024) ary incubated nandritra ny 30 minitra amin'ny mari-pana.Taorian'ny fanehoan-kevitra tampoka, dia nosasana inenina ny sela tamin'ny PBS misy 0.05% Tween-20 (Sangon, #A600560) (PBST) ary avy eo nosakanana tamin'ny 5% BSA (Abcone, #B24726) ao amin'ny PBST mandritra ny 30 minitra amin'ny mari-pana.
Ho an'ny immunostaining colocalization, ny sela dia natsipy tamin'ny antibody voalohany araka ny fepetra voalaza: totozy anti-V5 tag mAb (1: 500, CST, #80076), bitro anti-Hsp60 mAb (1: 1000), ABclonal, # A0564), bitro polyclonal anti-calnexin antibody (1:500, Abcam, #ab22595) na bitro anti-lamin A/C monoclonal antibody (1:500; CST, #2032) amin'ny 4 °C mandritra ny alina.Rehefa avy nanasa in-telo tamin'ny PBST, dia natsofoka tamin'ny antibody faharoa ny sela: osy anti-bitro Alexa Fluor 488 (Thermo, #A11034) natsofoka 1:1000, osy anti-mouse Alexa Fluor 594 (CST, #8889) voadio 1:1000.dilution Esory amin'ny mari-pana mandritra ny 30 minitra.Ny sela dia nosasana in-3 tamin'ny PBST ary nofafana tamin'ny DAPI (Thermo, #D1306) ao amin'ny PBS mandritra ny 10 minitra amin'ny mari-pana.Taorian'ny fanasana 3 tamin'ny PBS, ny sela dia nofehezina tamin'ny glycerol 50% (Sangon, #A600232) ao amin'ny PBS ho an'ny sary.Ny sary immunofluorescent dia azo tamin'ny alàlan'ny microscope confocal ZEISS LSM 900 Airyscan2 sy rindrambaiko ZNE 3.5.
Ho an'ny sary mihetsika fluorescent oksizenina singlet, ny sela dia nosasana indroa tamin'ny buffer Hanks HEPES alohan'ny hanampiana 100 nM Si-DMA ao amin'ny buffer Hanks HEPES (DOJINDO, #MT05).Rehefa avy nipoitra tamin'ny hazavana, dia natsofoka tao anaty incubator CO2 tamin'ny 37 ° C nandritra ny 45 minitra ireo sela.Avy eo dia nosasana indroa tamin'ny buffer HEPES Hanks ny sela ary nofafana tamin'ny Hoechst tao amin'ny buffer HEPES Hanks nandritra ny 10 minitra tamin'ny mari-pana amin'ny efitrano ary naseho tamin'ny alàlan'ny microscope confocal ZEISS LSM 900., #M36008) ao amin'ny buffer HBSS misy calcium sy magnesium.Rehefa avy nipoitra tamin'ny hazavana na doxorubicin (MCE, #HY-15142A), ny sela dia natsipy tao amin'ny incubator CO2 tamin'ny 37 ° C. nandritra ny 10 minitra, nosasana indroa tamin'ny buffer HBSS, ary nampidirina tamin'ny Hoechst ao amin'ny buffer HBSS amin'ny mari-pana.minitra.Doxorubicin dia nampiasaina ho toy ny fanaraha-maso tsara ny fikarohana izay nitsaboana sela tamin'ny 20 μM doxorubicin ao amin'ny HBSS misy 1% BSA mandritra ny 30 min.Ny sary immunofluorescent dia azo tamin'ny alàlan'ny mikroskopika confocal Zeiss LSM 900.
Ny sela HEK293T izay maneho ny mito-miniSOG dia voafafy amin'ny hakitroky ny 30% eo ho eo amin'ny lovia 15 cm.Taorian'ny ora 48, rehefa nahatratra ~ 80% ny fifandonana, dia nosasana indray mandeha tamin'ny PBS ny sela, natsipy tamin'ny 1 mM Probe 3 ao anaty buffer HBSS vaovao ao anatin'ny 1 ora amin'ny 37 ° C ary avy eo nohazavaina tamin'ny LED manga nandritra ny 10 minitra tao amin'ny efitrano. maripana..Avy eo dia nosasana indroa tamin'ny PBS ny sela, nokaravasina ary naverina tamin'ny buffer PBS mangatsiaka misy EDTA tsy misy protease inhibitors (MCE, #HY-K0011).Ny sela dia lysed tamin'ny sonication ny tendron'ny 1 minitra (1 segondra eo ary 1 segondra miala amin'ny 35% amplitude).Ny fifangaroana vokatr'izany dia natao centrifuged amin'ny 15,871 xg mandritra ny 10 min amin'ny 4 ° C mba hanesorana ny fako, ary ny fifantohana supernatant dia namboarina tamin'ny 4 mg / mL amin'ny fampiasana kitapom-panadinana proteinina BCA (Beyotime, #P0009).Ampifandraiso ny 1 ml ny lysate etsy ambony miaraka amin'ny biotin azide 0.1 mM photodegradable (Confluore, #BBBD-14), 1 mM TCEP (Sangon, #A600974), 0.1 mM TBTA ligan (Aladdin, #T162437), ary 1 mM CuSO4 incubator fihodinana miakatra 1 ora amin'ny mari-pana.Aorian'ny fanehoan-kevitra tampoka, ampio ny fangaro amin'ny vahaolana efa nafangaro (MeOH: CHCl3: H2O = 4 ml: 1 ml: 3 ml) ao anaty vilia fitaratra 10 ml.Ny santionany dia nafangaro ary nopetahana tamin'ny 4500 g nandritra ny 10 minitra tamin'ny mari-pana.Ny vahaolana ambany sy ambony dia nariana, ny entona dia nosasana indroa tamin'ny 1 ml methanol ary notsindriana tamin'ny 15871 × g nandritra ny 5 min tamin'ny 4 ° C.Ampio 1 ml 8 M urea (Aladdin, no. U111902) amin'ny 25 mM ammonium bikarbonate (ABC, Aladdin, no. A110539) mba handrava ny entona.Ny santionany dia naverina tamin'ny 10 mM dithiothreitol (Sangon, # A100281 ao amin'ny 25 mM ABC) mandritra ny 40 minitra amin'ny 55 ° C arahin'ny fanampiana 15 mM iodoacetamide vaovao (Sangon, # A600539) amin'ny mari-pana amin'ny efitra maizina.Alkylation ao anatin'ny 30 minitra..Nampiana dithiothreitol 5 mM fanampiny mba hampitsaharana ny fanehoan-kevitra.Omano manodidina ny 100 µl NeutrAvidin agarose vakana (Thermo, #29202) isaky ny santionany amin'ny fanasana in-3 amin'ny 1 ml PBS.Ny vahaolana proteome etsy ambony dia nopotehina tamin'ny 5 ml PBS ary natsipy tamin'ny vakana NeutrAvidin agarose efa nosasana nandritra ny 4 ora tamin'ny mari-pana.Ny vakana dia nosasana in-3 tamin'ny 5 ml PBS misy 0,2% SDS (Sangon, #A600485), in-3 miaraka amin'ny 5 ml PBS misy urea 1M, ary in-3 amin'ny 5 ml ddH2O.Ny vakana dia nojinjaina tamin'ny centrifugation ary naverina tamin'ny 200 μl of 25 mM ABC misy 1 M urea, 1 mM CaCl 2 (Macklin, # C805228) ary 20 ng / μl trypsin (Promega, # V5280).Trypsinize mandritra ny alina amin'ny 37 ° C miaraka amin'ny fihodinana.Natsahatra ny fanehoan-kevitra tamin'ny fampidirana asidra formic (Thermo, # A117-50) mandra-pahatongan'ny pH 2-3.Ny vakana dia nosasana in-3 tamin'ny 1 ml PBS misy 0,2% SDS, in-3 miaraka amin'ny 1 ml PBS misy 1 M urea, ary avy eo in-3 amin'ny rano 1 ml.Ny peptides novaina dia navoaka tamin'ny lysis maivana (365 nm) nandritra ny 90 min tamin'ny fampiasana 200 μl amin'ny 70% MeOH.Taorian'ny centrifugation dia nangonina ny supernatant.Ny vakana dia nosasana indray mandeha tamin'ny 100 μl ny 70% MeOH ary natambatra ny supernatant.Ny santionany dia maina tao anaty concentrator vacuum Speedvac ary tehirizina amin'ny -20 ° C mandra-pamakafaka.
Mba hamantarana sy hamaritana ny peptides oksizenina singlet, dia naverina indray ny santionany tamin'ny asidra formic 0.1% ary ny peptides 1 μg dia nodinihina tamin'ny fampiasana spectrometer faobe Orbitrap Fusion Lumos Tribrid misy loharano nano ESI avy amin'ny Tune sy Xcalibur avy amin'ny rindrambaiko mpivarotra 4.3.Ny santionany dia nisaraka tamin'ny tsanganana capillary 75 µm × 15 cm anatiny misy fitaovana 3 µm C18 (ReproSil-pur, #r13.b9.) ary mifandray amin'ny rafitra EASY-nLC 1200 UHPLC (Thermo).Ny peptides dia nosarahan'ny linear 95 minitra gradient chromatography avy amin'ny 8% solvent B ka hatramin'ny 50% solvent B (A = 0.1% formic asidra amin'ny rano, B = 0.1% formic asidra amin'ny 80% acetonitrile), dia nitombo tsikelikely ho 98% B min. ao anatin'ny 6 min amin'ny hafainganam-pandehan'ny 300 nl/min.Orbitrap Fusion Lumos dia manangona angon-drakitra mifandimby eo anelanelan'ny scan MS feno sy ny scan MS2 arakaraka ny angon-drakitra.Ny voltase sputtering dia napetraka ho 2.1 kV ary ny mari-pana amin'ny capillary fitaterana ion dia 320 ° C.MS spectra (350-2000 m/z) dia nangonina tamin'ny famaha 120,000, AGC 4 × 105, ary ny fotoana fampidirana ambony indrindra 150 ms.Ny precursors 10 be dia be mahazatra indrindra isaky ny scan feno dia nozaraina tamin'ny fampiasana HCD miaraka amin'ny herin'ny fifandonana mahazatra amin'ny 30%, varavarankely fitokanana quadrupole 1,6 m / z, ary ny famaha 30,000.Kendrena AGC ho an'ny spektrométrie faobe tandem mampiasa 5×104 ary fotoana fampidirana ambony indrindra 150 ms.Apetraka amin'ny 30 segondra ny exception dynamic. Ny ion tsy voatendry na ireo manana fiampangana 1+ sy >7+ dia nolavina noho ny MS/MS. Ny ion tsy voatendry na ireo manana fiampangana 1+ sy >7+ dia nolavina noho ny MS/MS. Неназначенные ионы или ионы с зарядом 1+ и >7+ были отклонены для МС/МС. Ion na ion tsy voatendry manana fiampangana 1+ sy >7+ dia nolavina ho an'ny MS/MS.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于 MS/MS。未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于 MS/MS。 Неуказанные ионы или ионы с зарядами 1+ и >7+ были отклонены для МС/МС. Ion na ion tsy voafaritra misy fiampangana 1+ sy >7+ dia nolavina ho an'ny MS/MS.
Ny angona manta dia karakaraina amin'ny alàlan'ny sehatra informatika FragPipe mifototra amin'ny MSFragger.Ny fitongilanana faobe sy ny asidra amino mifanaraka amin'izany dia nofaritana tamin'ny alàlan'ny algorithm fikarohana misokatra miaraka amin'ny fandeferana faobe mialoha ny -150 hatramin'ny 500 Da.Ny peptides novaina dia fantatra avy eo amin'ny fampiasana ny fanovana histidine miaraka amin'ny tombony betsaka amin'ny +229.0964 sy + 247.1069 Da ao amin'ny PD (Proteome Discoverer 2.5, Thermo).
Ny sela mampiseho ny fototarazo miniSOG mitambatra dia nopetahana tamin'ny lovia 6 cm.Rehefa tonga ny ~ 80% confluence, ny sela dia nosasana indray mandeha tamin'ny HBSS (Gibco, #14025092), avy eo dia natsipy tamin'ny probes simika tao amin'ny HBSS nandritra ny 1 ora tamin'ny 37 ° C ary nohazavaina tamin'ny hazavana manga.10W LED mandritra ny 20 minitra amin'ny mari-pana.Mba hamaritana izay karazana karazana oksizenina mihetsiketsika tafiditra ao amin'ny PDPL, 0,5 mM vitamin C (MCE, #HY-B0166), 5 mM Trolox (MCE, #HY-101445), D2O (Sigma, #7789-20-0) , 100 mM mannitol (Energy Chemical, #69-65-8), 100 μM H2O2, 10 mM NaN3 dia nampiana tao amin'ny sela ho fanampin-tsakafo.Rehefa avy nanasa tamin'ny mangatsiaka PBS, ny sela dia nokikisana, nangonina tao amin'ny 1.5 ml centrifuge fantsona, ary sonicated amin'ny tendron'ny ra 1 min amin'ny 200 μl ny PBS amin'ny 1x protease inhibitor tsy misy EDTA (1 s sy 1 s tsy misy, amplitude 35%).Ny fifangaroana vokatr'izany dia nopetahana tamin'ny 15,871 × g ho an'ny 10 min amin'ny 4 ° C ary ny fifantohana supernatant dia namboarina tamin'ny 1 mg / mL amin'ny fampiasana kitapom-panadinana proteinina BCA.Manodidina ny 50 µl amin'io lysate etsy ambony io no nampidirina tamin'ny 0.1 mM rhodamine azide (Aladdin, no. T131368), 1 mM TCEP, 0.1 mM TBTA ligan, ary 1 mM CuSO4 mandritra ny 1 ora amin'ny mari-pana amin'ny efitrano miaraka amin'ny fihodinana avy any ambany mankany ambony.Taorian'ny fihetsiketsehan'ny tsindry, ny rotsak'orana miaraka amin'ny acetone dia notanterahina tamin'ny fampidirana 250 μl acetone efa nangatsiaka ho an'ny santionany, natsofoka tamin'ny -20 ° C nandritra ny 20 min ary centrifuging amin'ny 6010 × g mandritra ny 10 min amin'ny 4 ° C.Angony ny pellet ary andrahoy ao anaty 50 µl 1x buffer Laemmli mandritra ny 10 minitra amin'ny 95 °C.Ny santionany dia nodinihina tamin'ny gels SDS-PAGE ary naseho tamin'ny alàlan'ny rafitra fakan-tsary Bio-rad ChemiDoc MP Touch miaraka amin'ny rindrambaiko Image Lab Touch.
Ny fanehoana sy ny fanadiovana ny recombinant miniSOG-6xHis proteinina dia natao araka ny voalaza teo aloha.Raha fohifohy, ny sela E. coli BL21 (DE3) (TransGen, # CD701-02) dia niova tamin'ny pET21a-miniSOG-6xHis ary ny fanehoana proteinina dia nampidirina tamin'ny 0.5 mM IPTG (Sangon, # A600168).Taorian'ny lysis sela, ny proteinina dia nodiovina tamin'ny alalan'ny Ni-NTA agarose vakana (MCE, no. 70666), dialyzed manohitra PBS, ary voatahiry ao amin'ny -80 ° C.
Ho an'ny fitiliana akaiky ny mari-pamantarana in vitro mifototra amin'ny antibody, afangaro ny miniSOG voadio 100 μM, 1 mM probe 3, ary 1 μg anti-label antibody monoclonal anti-label (TransGen, #HT501-01) ao amin'ny PBS amin'ny totalin'ny 50 μl..Ny fifangaroan'ny fanehoan-kevitra dia nodiovina tamin'ny jiro LED manga mandritra ny 0, 2, 5, 10, ary 20 min amin'ny mari-pana.Ny fifangaroana dia nampidirina tamin'ny 0.1 mM biotin-PEG3-azide (Aladdin, #B122225), 1 mM TCEP, 0.1 mM TBTA ligan, ary 1 mM CuSO4 mandritra ny 1 h amin'ny mari-pana amin'ny efitra fisakafoana.Aorian'ny fanehoan-kevitra vetivety dia ampio ny buffer 4x Laemmli mivantana amin'ny fangaro ary andrahoy amin'ny 95 ° C mandritra ny 10 minitra.Ny santionany dia nodinihina tamin'ny gel SDS-PAGE ary nodinihina tamin'ny famafazana tandrefana miaraka amin'ny streptavidin-HRP (1: 1000, Solarbio, #SE068).
Ny peptide synthetic misy histidine miaraka amin'ny C-terminal amidation (LHDALDAK-CONH2) dia nampiasaina handinihana ny peptide eo akaiky eo amin'ny marika in vitro.Amin'ity assay ity, 100 μM miniSOG nodiovina, 10 mM probe 3 ary 2 μg / ml peptide synthetic dia nafangaro tao amin'ny PBS tamin'ny totalin'ny fanehoan-kevitra 50 μl.Ny fangaro fanehoan-kevitra dia nodiovina tamin'ny jiro LED manga nandritra ny 1 ora tamin'ny mari-pana.Ny santionany microliter iray dia nodinihina tamin'ny alàlan'ny rafitra LC-MS (Waters, SYNAPT XS Ions Mobility Time-of-Flight mass spectrometer miaraka amin'ny rindrambaiko famakafakana spectrum MassLynx).
Ny sela HEK293T izay maneho ny fototarazo fusion miniSOG dia nafafy tamin'ny lovia 10 cm ho an'ny tsipika misy organelle localization (Mito, ER, Nucleus) ary lovia 15 cm ho an'ny tsipika Parkin-miniSOG sy BRD4-miniSOG.Rehefa tonga amin'ny ~ 90% confluence, dia nosasana indray mandeha tamin'ny HBSS ny sela, avy eo natsipy tamin'ny probe 3 tao amin'ny HBSS nandritra ny 1 ora tamin'ny 37 ° C ary nohazavaina tamin'ny LED manga 10 W amin'ny mari-pana.Ho an'ny marika tsy mifandray amin'ny Parkin, 10 µM proton carbonyl cyanide carrier m-chlorophenylhydrazone CCCP (Solarbio, #C6700) miaraka amin'ny probe 3 ao amin'ny HBSS dia nampiana adiny 1 amin'ny 37 ° C.Ny lysis sela, ny chimie click, ny reduction ary ny alkylation dia mitovy amin'ny voalaza etsy ambony, afa-tsy ny 2 mg of lysate dia nampiana ary ny biotin PEG3 azide dia nampiasaina tamin'ny fanehoan-kevitry ny tsindry fa tsy ny biotin azide azo simbaina.Taorian'ny fanatsarana, ny vakana dia nosasana in-3 tamin'ny 5 ml PBS misy 0,2% SDS, in-3 miaraka amin'ny 5 ml PBS misy 1 M urea, ary in-3 miaraka amin'ny 5 ml PBS.Avy eo, 2 µg trypsin dia nampiana 300 µl 25 mM ABC misy urea 1 M mba hanapaka ny proteinina mandritra ny alina amin'ny 37 ° C.Najanona ny fanehoan-kevitra tamin'ny fampidirana asidra formic mandra-pahatongan'ny pH 2-3.Taorian'ny trypsinization amin'ny vakana, ny vahaolana peptide dia nesorina tamin'ny fampiasana tsanganana SOLAµ HRP (Thermo, #60209-001) ary maina tao anaty concentrator vacuum Speedvac.Ny peptides dia naverina tamin'ny asidra formic 0.1% ary ny 500 ng peptides dia nodinihina tamin'ny fampiasana spektrometer faobe Orbitrap Fusion Lumos Tribrid miaraka amin'ny loharano nano-ESI voalaza etsy ambony.Ny peptide dia nisaraka tamin'ny tsanganana RP-HPLC ara-barotra (75 μm x 2 cm) (Thermo, no. 164946) ary tsanganana RP-HPLC analytical (75 μm x 25 cm) (Thermo, no. 164941), samy feno 2 μm.gradient avy amin'ny 8% ka hatramin'ny 35% ACN ao anatin'ny 60 minitra, avy eo dia nitombo tsikelikely ho 98% B tao anatin'ny 6 minitra amin'ny hafainganam-pandehan'ny 300 Nl/min.MS spectra (350-1500 m/z) dia nangonina tamin'ny famaha 60,000, AGC 4 × 105, ary ny fotoana fampidirana ambony indrindra 50 ms.Ny ion voafantina dia nozaraina tamin'ny HCD tamin'ny tsingerin'ny 3 s miaraka amin'ny angovo fifandonana mahazatra amin'ny 30%, varavarankely fitokanana quadrupole amin'ny 1.6 m / z, ary ny famaha ny 15000. A 5 × 104 tandem mass spectrometer AGC kendrena ary fotoana fanindroany ambony indrindra 22 ms no nampiasaina.Ny fanilikilihana mavitrika dia napetraka ho 45 segondra. Ny ion tsy voatendry na ireo manana fiampangana 1+ sy >7+ dia nolavina noho ny MS/MS. Ny ion tsy voatendry na ireo manana fiampangana 1+ sy >7+ dia nolavina noho ny MS/MS. Неназначенные ионы или ионы с зарядом 1+ и >7+ были отклонены для МС/МС. Ion na ion tsy voatendry manana fiampangana 1+ sy >7+ dia nolavina ho an'ny MS/MS.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于 MS/MS。未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于 MS/MS。 Неуказанные ионы или ионы с зарядами 1+ и >7+ были отклонены для МС/МС. Ion na ion tsy voafaritra misy fiampangana 1+ sy >7+ dia nolavina ho an'ny MS/MS.
Ny dingana fanomanana santionany mankany amin'ny fanatsarana ny vakana NeutrAvidin dia mitovy amin'ny fanadihadiana LC-MS / MS voalaza etsy ambony.Manodidina ny 50 μg ny lysate no nampiasaina ho fampidirana ho an'ny fanaraha-maso ny entana ary 2 mg ny lysate dia nampiasaina ho an'ny fanehoan-kevitra.Aorian'ny famenoana sy ny fanasana amin'ny neutravidin, dia nesorina ireo proteinina voafatotra tamin'ny fampidirana 50 μl ny buffer Laemmli amin'ny vakana agarose resin ary andrahoy amin'ny 95 ° C. mandritra ny 5 minitra.Ny fampidirana entana mifehy sy ny santionan'ny vakana dia nodinihina tamin'ny SDS-PAGE ary nafindra tany amin'ny fonon'ny PVDF (Millipore, #ISEQ00010) tamin'ny fomba mahazatra Western blot.Ny membranes dia nosakanana tamin'ny ronono 5% skim (Sangon, #A600669) ao amin'ny TBS misy 0.1% tween-20 (TBST) ary nampidirina tsikelikely miaraka amin'ny antibody voalohany sy faharoa.Ny antibody voalohany dia natsipy 1: 1000 amin'ny ronono 5% amin'ny TBST ary natsipy nandritra ny alina tamin'ny 4 ° C.Ny antibody faharoa dia nampiasaina tamin'ny tahan'ny 1: 5000 ary natsipy nandritra ny adiny iray tamin'ny mari-pana.Ny membranes dia naseho tamin'ny alàlan'ny chemiluminescence tamin'ny fampiasana ny rafitra imaging Chemidoc MP.Aseho ho angon-drakitra manta ny scans rehetra tsy tapaka amin'ny blots sy gels amin'ny tarehimarika.
Ny antibody voalohany ampiasaina amin'ity fanadihadiana ity dia ahitana ny antibody monoclonal anti-SFPQ bitro (CST, no. 71992), antibody monoclonal anti-FUS bitro (CST, no. 67840), antibody polyclonal anti-NSUN2 bitro (Proteintech, no. 20854-1- AP), antibody polyclonal anti-mSin3A bitro (Abcam, #ab3479), antibody monoclonal anti-tag anti-tag (TransGen, #HT201-02), antibody monoclonal anti-β-actin (TransGen, #HC201-01) -CDK2 monoclonal antibody (ABclonal, #A0094), bitro monoclonal antibody amin'ny CTBP1 (ABclonal, #A11600), bitro polyclonal antibody amin'ny DUT (ABclonal, #A2901), bitro polyclonal antibody amin'ny PSMC4 (ABclonal, #A2505), bitro anti- Antibody polyclonal DNAJB1 (ABclonal, # A5504).Ireo antibody ireo dia nampiasaina tamin'ny dilution 1: 1000 amin'ny ronono 5% amin'ny TBST.Ny antikora faharoa ampiasaina amin'ity fandalinana ity dia ahitana ny anti-bitro IgG (TransGen, #HS101-01), anti-mouse IgG (TransGen, #HS201-01) amin'ny dilution 1: 5000.
Mba hanadihadiana bebe kokoa raha mifandray amin'ny SFPQ ny BRD4, ny cellule HEK293T sy ny BRD4-miniSOG miorina amin'ny HEK293T dia nopetahana tamin'ny lovia 10 cm.Ny sela dia nosasana tamin'ny PBS mangatsiaka ary nodiovina tamin'ny 1 ml Pierce IP lysis buffer (Thermo Fisher, #87787) miaraka amin'ny inhibitor protease tsy misy EDTA mandritra ny 30 minitra amin'ny 4 ° C.Rehefa afaka izany, ny lysates dia nangonina tao amin'ny 1,5 ml centrifuge fantsona ary centrifuged amin'ny 15,871 xg nandritra ny 10 minitra amin'ny 4 ° C.Ny supernatant dia nojinjaina ary natsofoka tamin'ny 5 µg anti-V5 misy marika antibody monoclonal totozy (CST, #80076) mandritra ny alina amin'ny 4 ° C.Sasao eo amin'ny 50 µl proteinina A/G vakana magnetika (MCE, #HY-K0202) indroa miaraka amin'ny PBS misy 0,5% Tween-20.Avy eo ny lysate sela dia natsipy tamin'ny vakana magnetika mandritra ny 4 ora amin'ny 4 ° C miaraka amin'ny fihodinana avy any ambany mankany ambony.Avy eo dia nosasana in-efatra tamin'ny buffer PBST 1 ml ny vakana ary nandrahoina tamin'ny 95 ° C nandritra ny 5 minitra.Ny santionany dia nodinihina tamin'ny gel SDS-PAGE ary nafindra tany amin'ny fonon'ny PVDF tamin'ny fampiasana fomba fanao mahazatra tandrefana.Ny membranes dia nosakanana tamin'ny ronono 5% amin'ny TBST ary natsofoka tamin'ny antibody voalohany sy faharoa.Ny Antibody Kilonga Rabbit anti-SFPQ monoclonal antibody (CST, #71992) dia nampiasaina tamin'ny tahan'ny 1: 1000 amin'ny ronono 5% amin'ny TBST ary natsipy nandritra ny alina tamin'ny 4 ° C.Ny anti-bitro IgG dia nampiasaina tamin'ny tahan'ny 1: 5000 ary natsipy nandritra ny adiny 1 tamin'ny mari-pana.Ny membranes dia naseho tamin'ny alàlan'ny chemiluminescence tamin'ny fampiasana ny rafitra imaging Chemidoc MP.
Ny rafitra rehetra ampiasaina amin'ny famakafakana Solvent Accessible Surface Area (SASA) dia azo avy amin'ny Protein Data Bank (PDB)52 na ny AlphaFold Protein Structure Database53.Ny SASA tanteraka dia nokajiana ho an'ny ambiny tsirairay amin'ny fampiasana ny programa FreeSASA.Ny angon-drakitra SASA feno sy tsy misy dikany afa-tsy amin'ny histidine misy marika sy ny mpifanolo-bodirindrina aminy no nampiasaina mba hahazoana ny SASA midika ho an'ny rafitra tsirairay.Ny fidirana amin'ny solvent relative (RSA) ho an'ny histidine tsirairay dia nokajiana tamin'ny fizarana ny sandan'ny SASA tanteraka amin'ny alàlan'ny velaran-tany sisa tavela indrindra azo atao amin'ny solvent.Ny histidines rehetra dia sokajiana ho nafenina raha toa ka latsaky ny 20% ny RSA, raha tsy izany dia mibaribary56.
Ny rakitra manta azo tamin'ny fomba DDA dia nokarohina tamin'ny alàlan'ny Proteome Discoverer (v2.5) na MSfragger (Fragpipe v15.0) tao amin'ny angon-drakitra proteinina voamarina SwissProt izay misy loto mahazatra.Ny peptides dia nitaky trypsin feno miaraka amin'ny tranokala cleavage roa tsy hita, ny methylation carbamoyl ho fanovana raikitra ary ny oxidation methionine ho fanovana mavitrika.Ny fandeferana mialoha sy ny lanjan'ny ampahany dia napetraka amin'ny 10 ppm sy 0.02 Da (MS2 Orbitrap). Nesorina ny fikapohana loto, ary voasivana ny proteinina mba hahazoana taham-pahitana diso <1%. Nesorina ny fikapohana loto, ary voasivana ny proteinina mba hahazoana taham-pahitana diso <1%. Попадания загрязняющих веществ были удалены, а белки отфильтрованы, чтобы получить коэффициент ложного 1%. Nesorina ny fikapohana fandotoana ary voasivana ny proteinina mba hanomezana taham-pahitana diso <1%.去除污染物命中，过滤蛋白质以获得<1%的错误发现率。 <1%的错误发现率。 Попадания загрязняющих веществ были удалены, а белки отфильтрованы для достижения уровня ложных обнаружены. Nesorina ny fikapohana fandotoana ary voasivana ny proteinina mba hahazoana taha tsara diso <1%.Ho an'ny famakafakana quantitative tsy misy fampiasana labels, ny votoatin'ny proteinina mahazatra avy amin'ny famerenana biolojika telo dia nampiasaina.Ny famakafakana localization subcellular proteinina dia natao tamin'ny alàlan'ny famakafakana Gene Ontology (GO) avy amin'ny DAVID Bioinformatics Resources, MitoCarta 3.0 ary ny angon-drakitra natambatra sy navoakan'ny vondrona Alice Ting.Ny sarintany volkano dia azo avy amin'i Perseus (v1.6.15.0). Ny fiovan'ny fatran'ny proteinina dia nosedraina ho an'ny lanjany ara-statistika amin'ny fampiasana t-test misy lafiny roa, ary ny fikaonan'ny proteinina dia fantatra amin'ny fiovana be dia be> 2 (raha tsy misy filazana hafa) ary p <0.05. Ny fiovan'ny fatran'ny proteinina dia nosedraina ho an'ny lanjany ara-statistika amin'ny fampiasana t-test misy lafiny roa, ary ny fikaonan'ny proteinina dia fantatra amin'ny fiovana be dia be> 2 (raha tsy misy filazana hafa) ary p <0.05. Изменения кратности содержания белка были проверены на статистическую значимость с использованием двустороннего t-критерия, и совпадения белков были идентифицированы с изменением содержания> 2 (если не указано иное) и значением p <0,05. Ny fiovan'ny votoatin'ny proteinina dia nosedraina ho an'ny dikan'ny statistika amin'ny fampiasana t-test misy rambony roa, ary ny fifanandrinana proteinina dia fantatra amin'ny fiovan'ny atiny> 2 (raha tsy misy fanamarihana manokana) ary ny sanda ap <0.05.使用 双边 t 检验 测试 蛋白质 丰度 倍数 变化 的 统计 显着性, 并 确定 蛋白质 命 中 的 中 中 变化 变化> 2 (除非 另 有有) 和 p 值 <0.05.使用 双边 t 检验 测试 蛋白质 倍 数 变化 的 统计 显着性 并 确定 蛋白质 命 中 蛋白质 丰度 变化> 2 (另 有有) 和 p 值 <0.05. Статистическую значимость кратных изменений содержания белка проверяли с использованием двустороннего t-критерия, а совпадения белков определяли для изменений содержания >2 (если не указано иное) и p-значений <0,05. Ny lanjan'ny statistika amin'ny fiovan'ny viriosy amin'ny votoatin'ny proteinina dia nosedraina tamin'ny fampiasana t-test misy rambony roa, ary ny fifanandrinana proteinina dia nofaritana ho an'ny fiovan'ny votoaty> 2 (raha tsy misy fanamarihana manokana) sy ny p-values ​​<0.05.Ny famakafakana ny fifandraisan'ny proteinina dia natao tamin'ny alàlan'ny famakafakana GO miaraka amin'ny angon-drakitra String.
Replika biolojika telo no natao niaraka tamin'ny vokatra mitovy.Ny famakafakana ny antontan'isa dia natao tamin'ny GraphPad Prism (rindrambaiko GraphPad) ary ny volkano dia noforonina tamin'ny Perseus (v1.6.15.0).Mba hampitahana ireo vondrona roa ireo, ny p-values ​​dia nofaritana tamin'ny fampiasana t-test an'ny mpianatra roa-tailed.Ny proteinina tokana tokana ihany no fantatra fa indroa farafahakeliny ao amin'ny vondrona andrana no nampidirina tao amin'ny volkano, ary ny sanda tsy hita ao amin'ny vondrona mpanara-maso dia nosoloina Perseus avy amin'ny fizarana ara-dalàna mba ahafahana manitsy ny sanda p.Ny barana diso dia maneho ny mean ± deviation mahazatra.Ao amin'ny famakafakana proteomika ho an'ny famakafakana statistika, dia voatazona ny habetsahan'ny proteinina izay niseho tamin'ny replika biolojika roa farafahakeliny.Ny fomba statistika dia tsy nampiasaina mba hamaritana mialoha ny haben'ny santionany.Tsy kisendrasendra ny andrana.Ny mpikaroka dia tsy jamba tamin'ny asa nandritra ny fanandramana sy ny fanombanana ny vokatra.
Raha mila fanazavana fanampiny momba ny famolavolana fandalinana dia jereo ny sarintanin'ny Nature Research Report mifandray amin'ity lahatsoratra ity.
Ny angon-drakitra spectrometry faobe azo tamin'ity fanadihadiana ity dia natolotra ny ProteomeXchange Consortium tamin'ny alàlan'ny tahiry mpiara-miombon'antoka iProX57 eo ambanin'ny data ID PXD034811 (PDPL-MS dataset).Ny angona manta dia omena amin'ny endrika rakitra data manta.Ity lahatsoratra ity dia manome ny angona tany am-boalohany.
Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Fahafantarana ny manodidina: mampiasa biotinylation miankina akaiky mba hamaritana ny complexes proteinina sy ny organelles sarintany. Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Fahafantarana ny manodidina: mampiasa biotinylation miankina akaiky mba hamaritana ny complexes proteinina sy ny organelles sarintany.Gingras, AS, Abe, KT ary Raut, B. Fahalalana amin'ny manodidina: mampiasa biotinylation miankina akaiky mba hamaritana ny complexes proteinina sy ny organelles sarintany. Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Fahatakarana ny manodidina: ampiasao ny fiankinan'ny manodidina amin'ny fiainana biolojika.Gingras, AS, Abe, KT ary Raut, B. Fahatakarana ny akaiky: famaritana ny proteinina complexes sy ny sarintany amin'ny organelles mampiasa biotinylation miankina akaiky.Current.Ny hevitro.Chemical.biolojia 48, 44–54 (2019).
Geri, JB et al.Fametahana sarintany ny microenvironment amin'ny alàlan'ny famindrana angovo Dexter amin'ny sela immune.Science 367, 1091–1097 (2020).
Hertling, EL et al.Tambajotra mizana-proteome roa dia mahita ny fanavaozana ny sela manokana amin'ny fifandraisan'ny olombelona.Cells 184, 3022–3040.e3028 (2021).